[发明专利]一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶

说明书

本发明公开了一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述亮氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。本发明运用基因工程手段以pET‑28a为表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，并通过进一步筛选获得亮氨酸脱氢酶，该酶具有酶活较高，底物耐受性较好，热稳定性较高的特性，在工业生产中能够有效延长半衰期，达到降低生产成本的目的。

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物技术领域，尤其是涉及一种采用数据库基因挖掘的方法制备亮氨酸脱氢酶的过程。

背景技术

手性氨基酸是一类具有重要价值的医药中间体，在生物体内参与氧化、还原、水解及C-C键的形成，具有不同的生理功能，因此很多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等)的开发均使用了人工合成的手性氨基酸，在所有的手性氨基酸中，L-叔亮氨酸由于其叔丁基侧链的空间位阻大，且具有高度的疏水性，因此以其合成的手性药物在体内具有良好的生物稳定性，广泛应用于抗肿瘤抑制剂如治疗癌症、风湿性关节炎及抗HIV蛋白酶抑制剂的手性合成。

亮氨酸脱氢酶(Leucine Dehydrogenase，LeuDH，EC1.4.1.9)是一种以NADH 以及其氧化态为辅酶因子的氧化还原酶。该酶可催化L-亮氨酸及其他支链L型氨基酸的氧化，同时也能够可逆地将一些酮酸还原成对应的L型氨基酸。该酶最先由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中筛选而来，后来逐渐被发现存在于杆菌属、芽孢八叠球菌属、棒状杆菌属以及高温放线菌属等。

基于蛋白一级结构与蛋白表达的功能之间并没有绝对的对应关系，序列一致性高不代表催化性能也相似，若是关键的催化位点发生突变，则催化性质就会大不相同。所以我们可以利用基因挖掘的便利性，找到酶活较高，底物耐受性较好，热稳定性较好的亮氨酸脱氢酶，并对其用于制备L-叔亮氨酸进行研究，优化反应条件并放大制备体系，为进行工业化生产及应用做好准备。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶。本发明亮氨酸脱氢酶具有酶活较高，底物耐受性较好，热稳定性较高的特性，在工业生产中能够有效延长半衰期，达到降低生产成本的目的。

本发明的技术方案如下：

一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

一种编码所述亮氨酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

一种含有所述亮氨酸脱氢酶基因的表达载体。

一种含有所述表达载体的重组菌，所述重组菌由表达载体转化宿主细胞制得。

一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，制备方法为：

(1)构建重组菌，将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET-28a(+) 上，得到包含亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET-28a(+)-LeuDH，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+) -LeuDH；

(2)培养重组菌，将重组菌接种于50mL灭菌后的LB液体培养基中，37℃， 180rpm条件下过夜培养，按照1％的接种量将种子培养液接于含有50μg·mL^-1卡那霉素的50mL的LB液体培养基中培养至OD600为0.4～0.6时，加入终浓度为0.3mM的IPTG 25℃诱导15h；

(3)收集亮氨酸脱氢酶，培养后的重组大肠杆菌细胞冷冻离心，并用生理盐水清洗两次，用测定酶活力的缓冲液充分悬浮细胞，超声波破碎细胞，破壁后的菌体12000rpm冷冻离心10min，收集上清液，得到亮氨酸脱氢酶酶液。