[发明专利]一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物及其可视化检测方法

权利要求书

1.一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物，其特征在于：所述检测引物包括如下二对特异性引物对：

外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；

外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；

内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；

内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'。

2.一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：所述检测方法步骤如下：

步骤(1)根据甘薯薯瘟病菌基因组测序结果中的特异基因序列设计引物，得到针对6个区域的二对特异性引物对，所述二对特异性引物对如下：

外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；

外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；

内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；

内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'；

步骤(2)进行甘薯薯瘟病菌病原菌的分离和培养，得到甘薯薯瘟病菌病原菌的菌液；

步骤(3)提取步骤(2)所得菌液中的甘薯薯瘟病菌病原菌DNA；

步骤(4)LAMP扩增：以经步骤(2)处理所得的菌液和步骤(3)处理所得的甘薯薯瘟病菌病原菌DNA为模板，在恒温条件下利用步骤(1)所得4条特异性引物进行LAMP扩增，并对扩增产物进行显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测。

3.根据权利要求2所述的一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体步骤如下：

步骤(2.1)甘薯薯瘟病原菌分离与纯化：

取新鲜采集的薯瘟病害标本，洗净晾干，室内切片，显微镜下观察有溢菌现象的采用平板划线法进行分离；

无菌条件下切取病、健交界处的维管束数块，放在灭菌的载玻片上，滴上几滴无菌水使病组织块完全被浸泡，静置数分钟，用酒精灯烧过的接种环蘸取浸泡液一环在TTC平板上划线，倒置，28℃恒温箱培养24-48h，挑取单菌落于新鲜的TTC平板上划线1-2次，即可得到纯化菌株，保存备用；

步骤(2.2)菌株培养：将保存纯化的菌株活化接种于TTC平板上，置于28℃培养24-48h，挑取单菌落于新鲜NB培养基中，28℃，180r/min，培养16-18h，获得对数生长期的甘薯薯瘟病原菌的菌液，4℃保存备用。

4.根据权利要求2所述的一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中25μL的LAMP反应体系中各组分含量如下：20mMTris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、8.0mMMgSO₄、50mM KCl、0.8mM甜菜碱、1.4mmol·L^-1dNTPs、Bst DNA聚合酶8U、1.6μmolL^-1的FIP和BIP、0.2μmol·L^-1的F3和B3、Tween-20wt 0.1％，1μL模板菌液或模板DNA，无菌双蒸水补充至25μL，在PCR管盖上加入2μL 1000×SYBR GreenⅠ，LAMP反应条件为65℃1h，85℃灭活10min，冰上终止反应，反应结束后瞬时离心，将1000×SYBR GreenⅠ离心到PCR管的底部，观察颜色变化。

5.根据权利要求4所述的一种甘薯薯瘟病菌的LAMP可视化检测方法，其特征在于：LAMP反应结束后，显色反应的显色结果为绿色荧光的判断为阳性，显色结果为橙色的判断为阴性，或取5μL反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带的判断为阳性，无条带的判断为阴性。