[发明专利]一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物及其可视化检测方法

说明书

本发明提供一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物及其可视化检测方法，主要设计了一组甘薯薯瘟病菌的LAMP引物F3、B3、FIP、BIP；利用LAMP恒温扩增，扩增反应后通过显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可肉眼直接观察到荧光绿色或者电泳时梯形条带特征。本发明针对甘薯薯瘟病菌建立的环介导等温扩增技术可实现对带病组织(植株、薯块)中甘薯薯瘟病菌的快速检测，具有扩增快速、高效、特异性好、操作简便、不需要特殊仪器等优点，为甘薯薯瘟病菌防治提供可靠的技术依据。

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物及其可视化检测方法。

【背景技术】

由甘薯青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的甘薯薯瘟病是甘薯生产上一种图传细菌性病害，为植物检疫对象。近年来甘薯薯瘟病在我国国南方甘薯主产区不断扩大和蔓延，严重威胁着甘薯的生产。甘薯薯瘟病菌对甘薯的侵染过程普遍为从甘薯根茎部伤口或自然孔口侵入，先在皮层、细胞间隙等处定殖，随后在植物导管及附近组织内大量繁殖，并分泌胞外多糖堵塞导管并破坏周围组织，最终使植物萎蔫死亡，典型症状就是植株在萎蔫的状态下依然保持青绿颜色。但是，在发病中后期，甘薯茎秆变为褐色、黑褐色，植株萎蔫，与其他甘薯病害症状类似，如黑腐病、茎腐病等，且植物组织中微生物种类繁多。由于目前缺乏有效的病害早期诊断技术，发病后盲目大量使用药剂防治引起农药残留，造成食品安全问题，而且防治效果不理想。因此，研发出甘薯薯瘟病的早期快速诊断并进行及时监测，对保障甘薯产业健康生产及食品安全至关重要。

目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统检测方法耗时、耗力，且检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作过程耗时、复杂，检测成本高，PCR技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高，不适宜在基层部门推广应用。而最近科学家们研发出的环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是一种高效率的核酸等温扩增方法，该方法短时间内实现产物的大量扩增，灵敏度比PCR高，且操作步骤简便，无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合在基层生产部门推广应用。本发明基于环介导等温扩增(LAMP)技术，建立甘薯薯瘟病菌的可视化检测，根据LAMP技术原理和不同致病型薯瘟病菌菌株全基因组测序结果，选甘薯薯瘟病菌的特异序列的6个区域，设计出4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，以SYBR GreenⅠ的荧光显色指示剂作用，建立可视化LAMP检测技术。该体系对甘薯薯瘟病菌检测具有高的特异性与灵敏性。并在此基础上研发出可视化快速检测试剂盒。该技术是一种操作简单、灵敏度和特异性高的快速检测手段；无需特殊仪器设备，同时开发的快速检测试剂盒适合田间甘薯生产中开展实地检测与监测，从而保障甘薯健康生产及食品安全。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题之一，在于针对现有技术中的甘薯薯瘟病菌的传统的检测方法所需的检测周期长，特异性差，检测需要昂贵的仪器等问题，提供一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物，其具有快速、灵敏度高、特异性强等特点，可用于开发适合田间甘薯生产中开展实地检测的快速检测试剂盒，从而保障甘薯健康生产。

本发明是这样实现上述技术问题之一的：

一种甘薯薯瘟病菌的LAMP检测引物，所述检测引物包括如下二对特异性引物对：

外引物F3：5'-ACCAGTTAAAGAATGACCCA-3'；

外引物B3：5'-TGGCAATCCAAGGAATCC-3'；

内引物FIP：5'-GTAACGACCATGCCTGTCCAGATTGTTGTCAATGAAATGGGT-3'；

内引物BIP：5'-GCAGGCATTGCAGCATTGTTAACAATGATCACCAAAACGT-3'。