[发明专利]一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法

权利要求书

1.一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.设计靶向鸡基因组DNA的gRNA：选用的鸡基因组目标DNA序列为卵清蛋白第一内含子，根据不同种类Cas9蛋白的不同PAM序列规则，选择gRNA，所述gRNA的序列为TGTGCGTATACTCACACACG；

S2.构建gRNA的表达载体：根据PAM规则确定靶位点序列后，合成符合表达载体构建要求的靶位点序列正负DNA单链，退火形成DNA双链之后连接到CRISPR/Cas系统表达载体上，载体导入细胞后能表达gRNA和Cas蛋白；

S3.构建携带有外源基因表达框的供体载体：所述供体载体包括同源修复载体和非同源修复载体；所述外源基因表达框包括一段补全卵清蛋白基因第一内含子序列，一段使蛋白质分泌到细胞外的信号肽序列，一段任意目标外源蛋白的完整DNA序列和一段保护mRNA稳定性的polyA序列；所述一段补全卵清蛋白基因第一内含子序列，是从所选gRNA切割位点开始到第一内含子结束的序列；

S31.构建所述同源修复的供体载体：以单链DNA作为同源重组修复模板，上下同源序列以45bp-90bp；或以双链DNA作为同源重组修复模板，将目标DNA位点DSB处上游和下游各100bp-1000bp序列，分别连接在外源基因的5'端和3'端，作为同源臂，供体载体可以以闭环质粒或者线性DNA的形式存在；

S32.构建所述非同源修复的供体载体：PAM序列和靶位点序列组成一个切割位点框，切割位点框的反向互补序列为反向互补切割位点框，在供体载体中存在一个或者两个反向互补切割位点框，以闭环质粒或线性DNA的形式存在；

S4.将载体导入鸡个体：将步骤S2中制备好的任意gRNA/Cas9组合，和步骤S3中制备好的供体载体混合均匀后，注射到处于鸡胚发育X期的受精蛋中的胚盘下腔，随后对注射后的鸡胚进行电穿孔操作；或将步骤S2中制备好的任意gRNA/Cas9组合，和步骤S3中制备好的供体载体混合均匀后，将质粒混合液与核酸转染试剂按比例混合，之后注射到X期的鸡胚受精蛋中；随后孵化直至出雏。

2.根据权利要求1所述一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，其特征在于，所述补全卵清蛋白基因第一内含子序列补全后将不再含有所选用的gRNA识别和切割的位点。

3.根据权利要求1所述一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，其特征在于，所述信号肽序列为目标外源蛋白的原信号肽序列、鸡源溶菌酶信号肽、鸡源卵转铁球蛋白信号肽、鸡源类卵粘球蛋白信号肽或人工设计的信号肽。

4.根据权利要求1所述一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，其特征在于，所述任意目标外源蛋白为人血清白蛋白、白细胞介素、人凝血因子、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子、趋化性细胞因子、重组抗体中的任意一种。

5.根据权利要求1所述一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，其特征在于，所述polyA序列为利用鸡卵清蛋白原有polyA序列、额外添加BGH polyA序列、SV40 polyA序列中任意一种。