[发明专利]一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法

说明书

本发明提出了一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法，包括以下步骤：S1.设计靶向鸡基因组DNA的gRNA；S2.构建gRNA的表达载体；S3.构建携带有外源基因表达框的供体载体：所述供体载体包括同源修复载体和非同源修复载体；S4.将载体导入鸡个体。本发明利用结合CRISPR基因编辑技术，提高了外源基因整合到基因组中的准确率，实现高效率导入外源基因，制备出能够表达并分泌外源蛋白到鸡蛋蛋清中的转基因鸡，并实现外源基因稳定的遗传给后代。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种转基因鸡输卵管生物反应器。

背景技术

家禽输卵管生物反应器，主要是指以鸡为主的家禽，在输卵管组织中表达具有药用价值的外源蛋白并将其分泌到在所产禽蛋中随之排出体外。外源蛋白种类包括现已上市的各种重组蛋白，比如胰岛素，单克隆抗体等。早在1994年中国科学家曾杰(曾邦哲)就提出家禽输卵管生物反应器的概念及转基因禽类金蛋计划，并在1996年第一届国家转基因学术研讨会上与美国、加拿大、日本、英国等转基因实验室和开发商企业联系，随后美国Avigenics公司和Georgia大学R.Ivarie教授与曾杰开展了展开了通信讨论合作研究，直至1998年美国Avigenics公司才开展了立项和规模化投资与开发，2002年Avigenics公司在Nature Biotechnology上率先发表成功在转基因鸡蛋中表达了外源蛋白，但表达量只有1.34mg/L(蛋清液)。之后2003年英国罗斯林研究所也进入该领域，并由Sang支持课题组成立了公司。之后陆续有北美地区的公司开始了输卵管生物反应器的相关研究和开发，诸如TranXenoGEN、Viragen、GeneWorks等，其中成立于1996年的GeneWorks在当时获得了1800万美元的风险投资，但所有的研究都面临着表达量低下无法适用于反应器，离产业化十分遥远的问题，也体现了该领域最核心的问题，制备转基因家禽输卵管生物反应器的难度十分巨大。

家禽生殖模式较为特殊，精子进入阴道后，在家禽输卵管漏斗部与卵子结合并受精，停留2小时以上后，在此期间输卵管内分泌的卵蛋白将包裹受精蛋，之后在输卵管峡部形成蛋壳膜，然后形成蛋壳，总耗时长达18小时。排出体外的受精胚胎已经发育到囊胚晚期，命名为X期，已发育有5万至6万个细胞。其中原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)就起源与X期配盘的中央透明区，之后进入随着鸡胚发育进入血液循环系统，最后在进入性腺并形成精子和卵子。根据PGCs的迁移的规律，可以在胚胎发育后的11天左右从胚胎血液中收集和分离PGCs。从供体中分离得到的PGCs注入到第15期受体胚胎中，供体PGCs成功进入受体性腺并分化成生殖细胞，并将供体的遗传基因传递给后代(Vick L，Li Y，Simkiss K.Transgenic birds from transformed primordial germcells.Proc.R.Soc.Lond B Biol Sci,1993,251:179-182.)。

因为家禽特殊的生殖特点，使其无法像哺乳动物那样进行单细胞显微注射，遗传性只能依靠病毒载体的随机组合，而这种随机性导致高效特异性表达的难度增加。另一方面的研究集中在通过干细胞株的建立和通过体细胞进行禽类个体克隆，但难度依然巨大。外源基因高效、定向、可遗传的整合，和蛋清中至少亚克级别的高水平表达，目前这两方面的问题在国外还远未解决，现在鸡转基因所用的几种方法仍然是依赖随机性整合。近期禽蛋生物反应器研究主要集中在提高转基因效率以及筛选具有高水平表达的个体问题。这些问题得不到解决,禽蛋反应器就无法实现。

制备转基因家禽输卵管生物反应器主要技术瓶颈是随机整合的不确定性。本发明在现有的相关技术基础上，结合最新的基因编辑(genome editing)技术，从而大大提高整合的准确率，真正实现高效可遗传的导入外源基因。