[发明专利]构建多sgRNA表达载体的方法

权利要求书

1.一种构建包含串联的靶向不同基因组位点的N个sgRNA编码序列的表达载体的方法，其包括以下步骤：

1)提供如下的N-1个DNA片段：

第1个片段：G₁-S-P-G₂；……第N-1个片段：G_N-1-S-P-G_N，

其中G₁，……G_N代表N个分别靶向不同基因组位点的sgRNA向导序列，S代表sgRNA的框架序列，P代表驱动sgRNA表达的启动子，N是选自2-10的整数，

其中所述第1个片段的5′端还包含所述驱动sgRNA表达的启动子P或其部分序列，所述第N-1个片段的3′端还包含所述sgRNA的框架序列S或其部分序列；

2)提供线性化的表达载体，其中所述线性化的表达载体的一端具有所述驱动sgRNA表达的启动子P或其部分序列，另一端具有所述sgRNA的框架序列S或其部分序列；

3)将所述N-1个片段与所述线性化的表达载体混合，在合适的条件下进行同源重组，

由此产生包含串联的靶向不同基因组位点的N个sgRNA编码序列的表达载体。

2.权利要求1的方法，其中所述线性化的表达载体的一端具有所述驱动sgRNA表达的启动子P的部分序列与第1个片段的5′端的所述驱动sgRNA表达的启动子P的部分序列重叠，从而能进行同源重组。

3.权利要求1的方法，其中所述线性化的表达载体的一端的所述sgRNA的框架序列S的部分序列与第1个片段的3′端的所述sgRNA的框架序列S的部分序列重叠，从而能进行同源重组。

4.权利要求1的方法，其中所述N-1个DNA片段可以通过PCR扩增得到或可以直接化学合成获得。

5.权利要求1的方法，其中所述线性化的表达载体还含有另一启动子，以及与所述另一启动子可操作地连接的编码CRISPR核酸酶的多核苷酸。

6.权利要求5的方法，其中任选地，所述编码CRISPR核酸酶的多核苷酸还与调控基因表达的其他元件可操作地连接，例如终止子等。

7.权利要求5的方法，其中所述另一启动子是RNA聚合酶II启动子，包括EF1α启动子、CMV启动子、CBA启动子、hSynapsin启动子、HSV-TK启动子、SV40早期启动子和LSP启动子，优选CMV启动子。

8.权利要求5的方法，其中所述CRISPR核酸酶是Cas9。

9.权利要求8的方法，其中所述Cas9为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9或其变体。

10.权利要求1的方法，其中所述线性化的表达载体为线性化的质粒载体。

11.权利要求10的方法，其中所述质粒载体用于病毒载体如腺相关病毒(AAV)的包装。

12.权利要求10的方法，其中所述质粒载体衍生自pX601载体。

13.通过权利要求1-12的方法制备的包含串联的靶向不同基因组位点的N个sgRNA编码序列的表达载体。

14.权利要求13的表达载体，其中所述载体特别适合于在细胞中同时对多个基因组位点进行CRISPR介导的基因编辑。

15.一种试剂盒，其包含权利要求13-14的表达载体。