[发明专利]构建多sgRNA表达载体的方法

说明书

本发明涉及基因编辑领域。具体而言，本发明涉及构建多sgRNA表达载体的方法。更具体而言，本发明涉及通过同源重组构建包含串联的靶向不同基因组位点的N个sgRNA的表达载体的方法。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域。具体而言，本发明涉及构建多sgRNA表达载体的方法。更具体而言，本发明涉及通过同源重组构建包含串联的靶向不同基因组位点的N个sgRNA的表达载体的方法。

背景技术

成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白9(CRISPR-associated proteins 9，Cas9)在基础生物学研究、生物化学、农业、医药业等领域成为一种革命性的工具(Barrangou R,Fremaux C,Deveau H,et al.CRISPR provides acquired resistance against virusesin prokaryotes[J].Science,2007,315(5819):1709-1712.Doudna J A,CharpentierE.Genome editing.The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J].Science,2014,346(6213):1258096.Hsu P D,Lander E S,Zhang F.Development andapplications of CRISPR-Cas9for genome engineering[J].Cell,2014,157(6):1262-1278.Van Der Oost J,Westra ER,Jackson RN,et al.Unravelling the structural andmechanistic basis of CRISPR-Cas systems[J].Nat Rev Microbiol,2014,12(7):479-492.Barrangou R,Doudna JA.Applications of CRISPR technologies in research andbeyond[J].Nat Biotechnol,2016,34(9):933-941.)。它设计简单、操作便捷且成本较低，可用来切割或结合特定的DNA或RNA序列，逐渐成为基因编辑、基因调控、基因治疗等技术的标准应用程序。2012年Doudna等将CRISPR RNA(crRNA)与反式激活crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)连接并构建成单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)载体，证实与Cas9一起可在体外切割DNA片段。只需要改变sgRNA中与目的基因互补的序列，就可以造成DNA双链的断裂(double-strand break，DSB)(Jinek M,Chylinski K,Fonfara I,et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterialimmunity[J].Science,2012,337(6096):816-821.)。断开的DNA一般通过两条途径进行修复：主要是非同源末端连接(nonhomologous end joining，NHEJ)，造成断开位置的随机插入或缺失(Insertion or deletion，Indel)碱基(Lieber MR.The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway[J].AnnuRev Biochem,2010,79:181-211.)从而形成移码突变，进而造成基因敲除；另一条是同源重组修复途径(homology directed repair，HDR)，可利用带有同源臂的模板对切开位点进行特定修复(San Filippo J,Sung P,Klein H.Mechanism of eukaryotic homologousrecombination[J].Annu Rev Biochem,2008,77:229-257.)，行使基因的插入、缺失、突变等功能。2013年Feng Zhang团队和Church团队同时发表了，将CRISPR/Cas9系统用于真核细胞中进行基因组编辑，在基因研究中具有里程碑式的意义(Cong L,Ran FA,Cox D,etal.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J].Science,2013,339(6121):819-823.Mali P,Yang L,Esvelt KM,et al.RNA-guided human genomeengineering via Cas9[J].Science,2013,339(6121):823-826.)。