[发明专利]一种具有光热pH温度三重敏感型的红细胞仿生纳米凝胶的制备方法

权利要求书

1.一种具有光热pH温度三重敏感型的红细胞仿生纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取6~8周大小的ICR小鼠数只，使用毛细管进行眼球取血并在血中加入肝素抗凝，得到的全血在1-5℃，1800-2200 r/min离心8-12 min后去除上层的血清和其他血细胞层，得到的红细胞沉淀用冷处理后的1×PBS洗涤3~5次，备用；

2）向步骤1）得到的红细胞沉淀中加入相当于红细胞沉淀55-65倍体积的冷处理后的0.25×PBS低渗2~3 h；接着在9000-11000 r/min下离心15~20 min，弃去上层液体，下层淡粉色的沉淀即为红细胞膜，再用0.25×PBS反复洗涤3~5次使得提取的红细胞膜更为纯净，备用；

3）将0.008-0.012wt%的柠檬酸三钠水溶液加热至沸腾，然后迅速加入1~1.2 mL 0.8-1.2wt%的四氯金酸水溶液，继续加热至出现红色，再煮沸7~10 min出现透明的橙红色，即得到直径为45-55 nm的纳米金溶液，备用；

4）将2~3 g葡聚糖溶解在85-95℃的40~50 mL的8-12wt%的氯化锂/二甲基甲酰胺溶液中，完全溶解后降温至55-65℃，依次加入0.6~0.8 mL三乙胺、7.34~7.54 g顺丁烯二酸酐，通氮，搅拌，反应20~25 h，用100~150 mL预先冷藏的异丙醇重结晶反应液，静置，抽滤，得白色沉淀，备用；

5）将步骤4）得到的白色沉淀溶解在1-5℃的20~25mL双蒸水中，置于去离子水中透析，冷冻干燥得白色绒毛产物，即马来酰化葡聚糖，备用；

6）取20~25 mL 纳米金浓度为5.8-6.0 μmmol/L的溶液，并向该体系中加入0.1~0.12 g马来酰化葡聚糖，然后在室温下静置过夜，离心清洗2-4次后，将收集到的沉淀分散于5~10mL去离子水中，备用；

7）向步骤6）得到的悬浮液中分别加入0.1~0.12 g N-异丙基丙烯酰胺、1~2 mL 2.5-3.5mg/mL的N,N-亚甲基二丙烯酰胺溶液、600~700μL 4-6wt%阿霉素水溶液、1~2 mL 2.5-3.5mmoL/L十二烷基硫酸钠溶于20~25 mL去离子水中，通氮，室温下搅拌至反应体系中所有单体全部溶解，后加入0.3~0.5 mL 45-55mg/mL 2-氨基苯酚-4-磺酸，逐渐升温至65-75℃反应5~6 h，备用；

8）将步骤7）反应得到的溶液用0.45 μm滤膜过滤，滤液在去离子水中透析2-4天，即得阿霉素-金纳米棒-马来酰化葡聚糖- N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶溶液，备用；

9）将步骤2）得到的红细胞膜用1×PBS按照全血体积重悬后水浴超声2~3 min，再利用挤出仪分别通过400 nm和200 nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，得到的细胞膜悬液与步骤8）得到的阿霉素-金纳米棒-马来酰化葡聚糖- N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶溶液以1.8-2.2:1的体积比混合均匀后，共同通过200 nm的膜混匀反复挤出至少8次，得到红细胞仿生纳米凝胶，通过离心去除上层未包裹的多余细胞膜，即得到纯净的红细胞仿生纳米凝胶。

2.如权利要求1所述的一种具有光热pH温度三重敏感型的红细胞仿生纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤5）中，透析袋的截留相对分子量为10000，透析温度为1-5℃。

3.如权利要求1所述的一种具有光热pH温度三重敏感型的红细胞仿生纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤6）中，离心处理的转速为9000-10000 rpm，时间为10-20 min，温度为18-22℃。

4.如权利要求1所述的一种具有光热pH温度三重敏感型的红细胞仿生纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤8）中，透析袋的截留相对分子量为10000。

5.如权利要求1所述的一种具有光热pH温度三重敏感型的红细胞仿生纳米凝胶的制备方法，其特征在于，步骤9）中，超声功率为64 W，超声频率为50 kHz。