[发明专利]烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用

权利要求书

1.烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH 功能域基因的NtTS3基因，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi 载体，通过降低NtTS3基因表达延缓烟草叶片的衰老；

所述NtTS3基因的序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因克隆技术获得包含Zinc fingerCCCH 功能域基因的NtTS3基因包括以下步骤：

设计含有Gateway接头的NtTS3基因扩增引物和Gateway扩增引物，所述NtTS3基因扩增引物包括如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和如SEQ ID NO.2所示第一反向引物，所述Gateway扩增引物包括如SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物；

提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行退火梯度降落PCR扩增；

将上述退火梯度降落PCR扩增的产物片段切胶回收后，利用所述第二正向引物和第二反向引物进行普通PCR扩增；

将上述普通PCR扩增的产物回收纯化后，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207上，反应后将所得产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-pDonor207，其序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，退火梯度降落PCR扩增程序包括：步骤1:95 ℃ 3 min; 步骤2: 95 ℃ 30 S, 68 ℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3个循环；步骤3: 95 ℃30 S, 66℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3个循环；步骤4: 95 ℃ 30 S, 64 ℃ 30 S, 72 ℃ 1min; 3 个循环；步骤5: 95 ℃ 30 S, 62 ℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3 个循环；步骤6: 95℃ 30 S, 60 ℃ 30 S, 72 ℃ 1 min; 3 个循环；步骤7:95 ℃ 30 S, 58 ℃ 30 S, 72℃ 1 min; 1 个循环；步骤8: 72 ℃ 10 min。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207的反应体系和方法包括：pDonor207载体 1 μL、纯化后的PCR片段 3μL、BP酶 1 μL，将上述体系于25℃过夜连接。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老包括如下步骤：

通过LR反应将NtTS3-pDonor207连入最终过表达载体pEarlyGate101中，并将连接产物转入大肠杆菌DH5a中，鉴定提取阳性质粒，命名为NtTS3-101，获得促进烟草叶片衰老的阳性转基因材料。