[发明专利]烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用

说明书

本发明提出一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，属于基因工程技术领域，能够通过对NtTS3基因的调控促进或延缓烟草叶片的衰老，可对烟草叶片的衰老进行有效的人工干预，从而高效控制烟草的衰老进程。该技术方案包括利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH功能域基因的NtTS3基因，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老，利用RNAi技术获得NtTS3基因的RNAi载体，通过降低其表达延缓烟草叶片的衰老。本发明能够应用于烟草叶片衰老的调控中。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用。

背景技术

衰老是叶片发育的最后一个阶段，是一个受外因(气候环境、生物或非生物胁迫等)和内因(基因表达、激素含量等)综合作用的有序过程。叶片衰老是植物适应的表现，在逆境环境中，植物通过叶片衰老将能够重新利用的物质通过再循环再利用，分配到种子或者幼嫩器官，以增加植物抵抗外界不利环境。提早衰老或者推迟衰老在农业生产中都会对作物产生影响，植物叶片早衰，叶片光合作用时间变短，可能会导致农作物减产，有机物积累不够，品质会降低；另一方面，作物过晚衰老，又会影响作物正常生理周期，不利于栽培耕作。因此，如何高效调控作物衰老正在成为农艺学家解决作物高产高品质的有效途径之一。

烟草作为一类重要的经济作物，叶片是其主要收获器官；烟草叶片的状态直接影响到烟叶增产、烟农增收；烟草叶片不合时宜的衰老会给烟叶品质带来重大影响；在烟叶生产中常常会碰到因阴雨天气造成的烟叶“返青”现象，本应该成熟的烟叶，在环境影响下造成晚熟；这给后续的烤烟环节带来不利；因此，在烟草农业生产中，如何通过技术手段实现烟叶成熟的可控性，成为烟叶生产增产提质的有效策略。已有研究表明，在叶片衰老过程中大量转录因子基因表达受到影响，这些转录因子包括了NAC、WRKY等家族成员，它们通过相互协作影响叶片衰老进程，克隆并了解这些基因功能对理解叶片衰老过程极为重要。烟草中克隆到的相关基因还很少，因此，如何在烟草中克隆衰老相关基因并加以利用，从而对烟草叶片的衰老进行人工干预，这将具有重要利用意义。

发明内容

本发明提出一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，能够通过对NtTS3基因的调控促进或延缓烟草叶片的衰老，可对烟草叶片的衰老进行有效的人工干预，从而高效控制烟草的衰老进程。

为了达到上述目的，本发明提供了一种烟草NtTS3基因在控制烟草叶片衰老中的应用，包括以下步骤：

利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH功能域基因的NtTS3基因，通过过量表达NtTS3基因促进烟草叶片的衰老，利用RNAi技术获得NtTS3 基因的RNAi载体，通过降低其表达延缓烟草叶片的衰老。

作为优选，利用基因克隆技术获得包含Zinc finger CCCH功能域基因的NtTS3基因包括以下步骤：

设计含有Gateway接头的NtTS3基因扩增引物和Gateway扩增引物，所述NtTS3基因扩增引物包括如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和如SEQ ID NO.2所示第一反向引物，所述Gateway扩增引物包括如SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和如SEQ ID NO.4所示第二反向引物；

提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用所述第一正向引物和第一反向引物进行退火梯度降落PCR扩增；

将上述退火梯度降落PCR扩增的产物片段切胶回收后，利用所述第二正向引物和第二反向引物进行普通PCR扩增；

将上述普通PCR扩增的产物回收纯化后，通过gateway试剂盒连接到中间载体pDonor207上，反应后将所得产物通过化学转化方法转入大肠杆菌DH5a 中，测序提取阳性克隆质粒，命名为NtTS3-pDonor207，具有如SEQ ID NO.5 所示序列。