[发明专利]烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用

权利要求书

1.烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

克隆得到烟草NtPED基因，通过过量表达NtPED基因降低烟草叶柄与茎间的角度；或

利用基因编辑技术使烟草NtPED基因的功能缺失，而增大烟草叶柄与茎间的角度；

所述NtPED基因的序列如SEQ ID NO.15所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，克隆得到烟草NtPED基因的步骤包括：

提取烟草叶片RNA并反转录为cDNA，以此为模板，利用SEQ ID NO.1所示的第一正向引物和SEQ ID NO.2所示的第一反向引物进行第一次PCR扩增；

以上述第一次PCR扩增产物稀释50倍为模板，利用SEQ ID NO.3所示的第二正向引物和SEQ ID NO.4所示的第二反向引物进行第二次PCR扩增；

将上述第二次PCR扩增的产物片段切胶回收后，通过BP反应连接到gateway中间载体pDonor207上，并将所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得含有烟草叶柄调控基因NtPED的载体，命名为NtPED-pDonor207，其序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，第一次PCR扩增和第二次PCR扩增的扩增条件为：95℃5min；33个如下循环：95℃30s、58℃30s、72℃1min；72℃10min。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因编辑技术使烟草NtPED基因的功能缺失的步骤包括：

根据烟草NtPED基因序列设计21bp长度的位于烟草NtPED基因5’端的基因编辑靶序列，将SEQ ID NO.6所示的第三正向引物和SEQ ID NO.7所示的第三反向引物退火后获得用于CRISPR-CAS9基因编辑的靶序列，将退火产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9中，然后转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体，命名为NtPED-pCAS9，其序列如SEQ ID NO.14所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，退火体系为：5x退火缓冲液,10μL；第三正向引物,10μL；第三正反向引物,10μL；ddH₂O₂,10μL；将上述体系在PCR仪中98℃放置10min后，立刻于室温中自然冷却；

将所得产物经T4连接酶连接入基因编辑最终载体pCas9的反应体系为：2μL BsaI酶切后的pCAS9载体、1μL T4连接酶缓冲液、1μL T4连接酶、6μL退火所得产物，将上述体系在室温下放置10min。

6.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，通过过量表达NtPED基因降低烟草叶柄与茎间的角度或通过使烟草NtPED基因的功能缺失而增加烟草叶柄与茎间的角度的步骤包括：

通过LR反应将所述烟草叶柄调控基因连入过表达载体pEarlyGate101中，将过夜所得产物转化进入大肠杆菌DH5a中，鉴定获得过量表达载体NtPED-101；

通过将所述过量表达载体NtPED-101转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得烟草叶柄与茎间角度降低的阳性转基因材料；或

通过将使烟草NtPED基因功能缺失的基因编辑载体转化进入农杆菌GV3101中，利用叶盘法转化烟草叶片，通过抗性筛选及分子鉴定获得烟草叶柄与茎间角度增大的阳性转基因材料。