[发明专利]一种环形泰勒虫病疫苗保护剂及制备方法

说明书

本发明公开一种环形泰勒虫病疫苗保护剂及其制备方法。本发明的环形泰勒虫病疫苗保护剂由：食用明胶2%、亚硒酸钠0.01%、硫酸锌0.01%和双抗1%组成，缓冲体系为0.01M PBS(PH7.2‑7.4)和RPMI‑1640。本发明的环形泰勒虫病疫苗保护剂可延长疫苗在4℃冷链环境运输过程中的保存期，细胞在保存90天后，细胞活力维持在89%以上，细胞具备再生长的能力。本发明的结果延长了疫苗的保存期，为环形泰勒虫病的免疫防治提供了有力的技术支持。

技术领域

本发明涉及一种微生物的保护剂，特别涉及一种环形泰勒虫病疫苗保护剂及其制备方法。

背景技术

牛环形泰勒虫病是一种蜱传性血液原虫病，该病病原寄生于牛的淋巴细胞和红细胞内，临床主要表现为高热、贫血、黄疸和体表淋巴结肿胀等症状，该病发病率和病死率高，给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。

环形泰勒虫感染牛淋巴细胞后，在细胞内形成裂殖体，裂殖体感染的宿主细胞在体外培养时，可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力，而且通过细胞传代培养可使虫体致弱。业已证实，裂殖体阶段的虫体具有很强的抗原性和免疫原性，使用环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞制备的疫苗，可以诱导宿主产生较强的抗环形泰勒虫感染的能力。现有疫苗采用七十年代研制胶冻疫苗保护剂，由兰州兽医研究所研制，该保护剂通过添加乳白蛋白水解物和蔗糖为主要保护剂成分对细胞进行保护，细胞在保存50天后活力下降至33.5%，不能对细胞起到很好的保护作用。研究表明，虽然选用环形泰勒虫裂殖体阶段虫体制备疫苗能够很好的控制本病的传播与流行，但疫苗须保存在液氮或干冰中，而在4℃条件下保存期短，严重影响了该疫苗的运输和使用，以及疫苗的应用与推广。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的环形泰勒虫病疫苗保护剂，以及这种保护剂的制备方法。

本发明的环形泰勒虫病疫苗保护剂是以质量体积百分含量计算下列组分组成：食用明胶2%，亚硒酸钠0.01%，硫酸锌0.01%，双抗1%（注：青霉素工作浓度为100U/ml，链霉素工作浓度为0.1mg/ml），缓冲体系为0.01M PBS(PH7.2-7.4)和RPMI-1640。

本发明所述的疫苗保护剂各组份的制备方法，首先用PBS缓冲液将食用明胶溶解，调整胶浓度，10磅高压灭菌15分钟后4℃保存备用，其次将亚硒酸钠和硫酸锌溶解于RPMI-1640中，用0.22um滤器过滤除菌后4℃保存备用。该方法通过优化筛选，确定了一种能够对细胞起到很好保护效果的保护剂组分。

本发明的环形泰勒虫病疫苗保护剂的使用方法是：先用前述方法制备出食用明胶溶液和亚硒酸钠和硫酸锌溶液，再进行以下步骤：

a.细胞培养：将连续传代至第20代的环形泰勒虫裂殖体感染的牛淋巴细胞在T75细胞培养瓶中静置培养3天，使细胞生长到旺盛期，细胞密度与活力最佳时用于疫苗制备；

b.保护剂制备：将配置好的亚硒酸钠和硫酸锌添加到食用明胶中，使得明胶的含量在2%，亚硒酸钠含量为0.01%，硫酸锌含量为0.01%，同时添加1%双抗，充分混匀后用于疫苗的制备；

c.疫苗制备：将生长旺盛期的细胞离心，弃上清，沉淀用b配制的保护剂悬浮，调整细胞浓度至2.5×10⁶细胞/mL，使细胞均匀分散到保护剂中制备疫苗，置于4℃保藏。

保护剂中添加的微量元素硒是一种多功能营养素，具有抗氧化作用的细胞保护剂，研究发现添加低浓度硒对细胞具有保护性作用，高浓度的硒可引起细胞的损伤，降低细胞的活性。为获得对细胞的保护性作用，可针对细胞的种类和生长环境选择具体的硒添加浓度。本研究选取亚硒酸钠与明胶保护剂合理的配比，能够很好的保护细胞在存放过程中代谢与存活，提高了产品在保存与使用过程中的稳定性。通过对疫苗保护剂组分的筛选与优化得出的本发明保护剂可以提高疫苗保存效果，降低保存条件，满足本病免疫防控的需求，有助于该疫苗的应用与推广。