[发明专利]C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法

说明书

C肽化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法，属于免疫分析领域，解决了现有定C‑P检测方法存在的灵敏度低、反应时间长、成本高的问题。该试剂盒包括链霉亲和素包被的磁微粒；生物素标记的C肽抗体；吖啶酯标记的C肽抗体；清洗缓冲液；化学发光预激发液；校准品；质控品。检测方法为：样品中的C肽抗原与生物素标记的C肽抗体、吖啶酯标记的C肽抗体发生免疫反应，形成生物素‑C肽抗体‑C肽抗原‑C肽抗体‑吖啶酯溶剂；链霉亲和素包被的磁微粒与生物素相结合，形成磁珠‑链霉亲和素‑生物素‑C肽抗体‑C肽抗原‑C肽抗体‑吖啶酯复合物；加入清洗缓冲液等，计算出C肽浓度。本发明灵敏度高、特异性好、反应时间短、成本低。

技术领域

本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。

背景技术

C肽原是由C肽B链、C肽和C肽A链组成。C肽B链是从第1个氨基酸到第30个氨基酸；C肽是从第33个氨基酸到第63个氨基酸；C肽A链是从第66个氨基酸到第86个氨基酸。C肽是通过第31、32位的精氨酸和第64位赖氨酸、65位精氨酸连接C肽的B连和A链。C肽原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，经蛋白水解酶的作用，切去第31、32位的精氨酸和第64位赖氨酸、65位精氨酸，生成没有活性的C肽，同时C肽原中的A链和B链连接生成C肽。一分子的C肽原分解为一分子C肽和一分子C-肽。C肽由31个氨基酸分子组成，分子量为3020Da。C肽与C肽以等克分子量从B细胞分泌到血液中，不被肝细胞所摄取，主要在肾脏中代谢并从肾脏排出体外。

C肽不受C肽抗体的干扰，对于接受C肽治疗的病人，测定C肽水平可以评估残存β细胞的功能。C肽主要通过肾脏降解和排泄，所以尿液中的C肽浓度高于血清中的浓度。尿C肽具有不受C肽原的影响、留取样本方便等特点，检测24小时尿C肽可反映受检者一段时间内血中C肽的平均值。

人胰岛素原(proinsulin)是由胰岛素和C肽组成，具有双重免疫活性，既可与胰岛素抗体结合，又可与C肽抗体结合。在生理情况下，只有极少量的C肽原释放入血，在病理情况下，胰岛β细胞释放C肽原增多，血中C肽原水平升高。由于C肽原的浓度还不到C肽的十分之一，故一般测得C肽(总C肽)可代表血中的游离C肽。

目前用于检测C肽的免疫分析方法主要有酶联免疫分析法和化学发光免疫分析法。酶联免疫分析法采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记抗体，用于催化发光底物产生颜色变化，操作简单，但是标记物易失活，发光底物需要避光，试剂的检测灵敏度较低，导致测试结果不准确。化学发光免疫分析法采用催化剂催化化学发光物质形成一种激发态中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，发出光子，具有操作简单，自动化程度高，检测速度快等优点。

目前市售的C肽(C-P)检测试剂盒主要分为以下3种：一是ELISA方法即辣根过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记一株C-P抗体，固相载体(微孔板或固相微粒)包被另一株C-P抗体，利用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶催化发光底物产生颜色变化，检测血清或血浆中C-P的浓度；二是采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体，采用FITC抗体-FITC将C-P抗体间接偶联至磁微粒表面；三是三联吡啶钌电化学发光法，采用链霉亲和素磁珠，一株C-P抗体标记生物素，另一株C-P抗体标记三联吡啶钌，经过免疫反应形成磁珠-链霉亲和素-生物素-C-P抗体-C-P抗原-C-P抗体-三联吡啶钌复合物，在电场加压条件下发光。

以上定量检测C-P的方法存在以下缺陷：1)ELISA方法采用微孔板或固相微粒作为固相载体，包被密度有限，灵敏度较低，反应时间较长；2)采用异鲁米诺衍生物直接标记抗体，采用FITC抗体-FITC将C-P抗体间接偶联至磁微粒表面，将引入更多的影响因素，影响检测结果的灵敏度；3)采用三联吡啶钌的电化学发光法，仪器要求较高，试剂及仪器都比较昂贵。

发明内容

为了解决现有定量检测C-P的方法存在的灵敏度低、反应时间长、成本高的问题，本发明提供一种C肽化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。