[发明专利]以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用

权利要求书

1.以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法，其特征在于，以冻存脐带间质组织的形式保存脐带中相关的多种干细胞，冻存方法包括以下步骤：

A.华通氏胶分离：使用生理盐水洗涤脐带2-3次，用组织剪剪去脐带两头再涮洗2次，后用尖头直剪将脐带剪成2cm的小段，之后沿其静脉血管平行方向前开小口，再用组织镊纵向撕开、展平，将3根血管以及羊膜从脐带中剥离干净，剩余华通氏胶部分用生理盐水充分洗涤3次，转移至离心管中，剪至1-2cm³的小块；

B.进行预处理：离心管中加入含有DMSO的α-MEM保护剂浸没全部组织块，置于4～10℃进行浓度平衡10～20分钟，后离心，去除上清液，放入冻存管中；

C.组织冻存：向冻存管中加入右旋糖酐或胎牛血清，重悬华通氏胶小块，再加入含有DMSO的α-MEM保护剂构成冻存保护剂，后进行组织降温冻存。

2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO的体积比为5％-15％，加入的右旋糖酐或胎牛血清占冻存保护剂总体积的体积比为50％-65％。

3.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，其中所述组织降温冻存是按照程控降温方法进行，所述程控降温方法步骤为：3～6℃保持4～10min；以2～5℃/min降至-10℃，保持12～20min；以0.5～3℃/min降至-50℃，保持5～10min；以35～55℃/min降至-90℃，保持5～15min，最后将组织装入液氮保存。

4.根据权利要求3所述的冻存方法，其特征在于，所述程控降温方法的步骤为：4℃保持6min；以3℃/min降至-10℃，保持15min；以1℃/min降至-50℃，保持7min；以40℃/min降至-90℃，保持10min，最后将组织装入液氮保存。

5.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，其中所述组织降温冻存是按照分级慢冻方法进行，所述分级慢冻方法的步骤为：放入预冷的程序降温盒中，转入低温冰箱保存24h，再转入液氮中保存。

6.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO体积比为10.5％，加入的胎牛血清占冻存保护剂总体积的体积比为55％。

7.根据权利要求5所述的脐带组织冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO体积比为10.5％，加入的胎牛血清占冻存保护剂总体积的体积比为55％。

8.根据权利要求4所述的脐带组织冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO体积比为12％，加入的右旋糖酐占冻存保护剂总体积的体积比为55％。

9.一种对冻存的脐带组织进行复苏的方法，其特征在于包括以下步骤：

a.将组织冻存管从液氮中取出快速放入已事先准备好的37℃恒温水浴中，并不停在水中划动，直到组织解冻80％，再将组织冻存管放于洁净工作台中；

b.解冻的组织块快速转入已预冷的含有MEM培养基的离心管中，于低温离心，去除上清液；

c.再低温离心，去除上清液。

10.权利要求1-7任一项所述的方法在脐带组织冻存中的应用。