[发明专利]以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用

说明书

本发明涉及以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用，具体步骤包括：采用对脐带组织进行清洗之后剪成组织段、剥离间质华通氏胶组织；利用含有DMSO的α‑MEM保护剂预处理，置于4‑10℃进行浓度平衡10‑20分钟，后低温离心，去除上清液；加入右旋糖酐或胎牛血清与含有DMSO的α‑MEM保护剂共同构成冻存液，采用程控降温或分级降温的方式对组织进行冻存。本发明的冻存方法可有效保护冻存脐带组织，而且方便进行后续的复苏操作，且复苏后的组织培养出的细胞活性与新鲜组织中的细胞无差别。

技术领域

本发明涉及生命科学技术领域，具体涉及以冻存脐带间质组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用。

背景技术

脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉和一条静脉组成，在其间隙中可以看到疏松、胶状的间充质。人脐带中的华通氏胶(Wharton’s Jelly)组织可分离得到间充质干细胞(Mesenchymol Stem Cells，MSC)、上皮干细胞(epithelial stemcell，ESC)以及内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)等多种干细胞，脐带来源的MSC具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性低等优点，每15～20g脐带华通氏胶组织可以分离得到约10⁷原代MSC。MSC目前发现的可阳性表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90(Thy-1)、CD105(endoglin)和CD166，但不表达CD14、CD34、CD38和CD45。2006年国际细胞治疗协会已制定并发布了MSC应具有形态学、免疫表型和诱导分化3个生物学特征指标^[3]。已证实，MSC是一类可分化成中胚层多种组织的多能成体干细胞，而且已被证实^[4]MSC能够分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等，而且它在体内和体外还具有调节和抑制免疫反应的能力。目前在临床对多种疾病具有一定的效果，因此储存MSC可为医学提供大量的素材。

目前，行业内脐带MSC的保存做法是，先从华通氏胶中分离得到MSC，再经过20天的培养以扩增培养到一定数量细胞后进行深低温保存。但该方法周期长，制备成本高，而且脐带中的其他类型的组织和剩余的华通氏胶组织都将被作为废弃物丢弃，造成了样本资源浪费。因此，研发一种能够保存多种干细胞即完整、快速保存脐带组织的方案显得十分重要。

中国发明专利(CN201710948676.7)公开了一种脐带组织冻存、复苏方法，该发明采用细胞团块而非单个细胞进行冻存，降低细胞受损凋亡的概率，但是此方法仍为细胞冻存，未实现真正意义上的组织冻存。本发明直接从组织块进行冻存，提高冻存及复苏效率和得率。

中国发明专利(CN201711424190.X)公开了一种脐带组织冻存复苏方法，其技术方案实际记载了冻存过程中的所用到的多种玻璃化液，其实际内容是对于冻存保护液的设计，并没有完整的脐带组织冻存方案，且冻存过程中保护液种类繁多，分三步进行冻存，且冻存包括脐静脉和华通氏胶，不同组织采用同一冻存方法可能会影响冻存效果，本发明直接采用程序降温控制降温速率，简化降温过程，有效保护冻存活性，并冻存纯的华通氏胶组织，保证冻存质量。

中国发明专利(CN201611082580.9)公开了一种脐带组织冻存液及冻存方法，其技术方案详细记载了一种冻存保护液，对于冻存过程没有详细的设计，其实际内容也是提供了一种新的冻存保护剂，未公开具体的冻存步骤.而本发明通过详细对比试验确定了最佳冻存方案。

中国发明专利(CN201810066298.4)公开了一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用，其技术方案记载了一种冻存保护液的配方及这种冻存保护液的制作步骤，而其关于脐带组织冻存中仍然记载的是对于培养后细胞团的冻存方法，未完全实现组织冻存，本发明采用分离处理后直接冻存方法，缩短制备周期，提高得率。