[发明专利]一种减少蛋白在protein L凝胶层析中形成多聚体的方法

说明书

本发明涉及一种减少蛋白在protein L凝胶层析中形成多聚体的方法，包括：(1)在protein L洗脱体系中加入半胱氨酸(Cys)，利用NaOH溶液中和洗脱体系；(2)蛋白protein L凝胶层析纯化后的样品利用G25葡聚糖凝胶层析处理，用于去除Cys。本发明有效抑制了低pH洗脱引起的多聚体形成，且纯化蛋白没有发生降解。本发明工艺操作简单，效果明显，为实验室研究及工业生产中protein L凝胶层析工艺提供参考，也为进一步研究去除其它类似蛋白在纯化中形成多聚体的方法提供了新思路。

技术领域

本发明涉及一种减少蛋白在protein L凝胶层析中形成多聚体的方法，属于生物技术技术领域。

背景技术

Protein L是一种适用于抗体和抗体片段捕获的亲和层析介质(树脂)，可在不影响抗原结合的情况下与免疫球蛋白及免疫球蛋白的Kappa(κ)轻链结合，具有更广阔的抗体片段选择范围，更高的纯度和产量。但是其目蛋白的最佳洗脱条件pH值较低，一般pH值为3甚至更低的条件，高浓度蛋白在较低pH环境下极不稳定，容易形成多聚体，影响层析后蛋白的分子排布和活性回收效率。

重组蛋白是一种以人表皮成长因子受体(HER2)为识别靶点的高活性重组融合蛋白，是一种新型靶向抗乳腺癌蛋白药物。具有生产工艺简单，生物活性高，产物杂质少等优点，有很好的应用价值和市场前景。在使用protein L层析柱纯化过程中，因洗脱条件制约而形成一定量的多聚体。多聚体的形成及含量的多少直接影响了制品的质量、临床用药的安全和产品的合格率。从医药安全性出发，尽可能降低或去除多聚体的含量是非常重要的工艺环节之一。目前研究表明该方法可在提高融合蛋白纯度的基础上，显著抑制重组蛋白多聚体的形成，使其达到一定质量指标要求。。

发明内容

本发明的目的在于提供一种减少蛋白在protein L凝胶层析中形成多聚体的方法，本发明通过对protein L层析使用的洗脱缓冲液中添加半胱氨酸等试剂，解决了纯化中多聚体形成的问题。以此提高蛋白质纯度及纯化效率，并为研究其它类似蛋白纯化中产生多聚体的去除提供参考。本发明的技术方案如下：

一种减少蛋白在protein L凝胶层析中形成多聚体的方法，包括

(1)在protein L洗脱体系中加入半胱氨酸(Cys)，利用NaOH溶液中和洗脱体系；

(2)蛋白protein L凝胶层析纯化后的样品利用G25葡聚糖凝胶层析处理，用于去除Cys；

所述步骤(1)中洗脱体系的pH为2.0-7.0；优选的，洗脱体系选自柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液中的任意一种。

融合蛋白4D5Fv-PE25包含曲妥珠单抗的可变区Fv与绿脓杆菌外毒素PE25(发明名称为融合蛋白4D5Fv-PE25及其制备方法和用途，申请号为201510674652.8)

进一步的，在洗脱体系中加入0.1M的Cys，利用0.5M的NaOH溶液中和洗脱体系至pH为8.5±0.3。

更进一步的，减少融合蛋白4D5Fv-PE25在protein L凝胶层析中形成多聚体的方法，具体步骤如下：

(1)用5倍柱体积的PBS平衡液平衡protein L凝胶层析柱；

(2)将融合蛋白4D5Fv-PE25以20mg/ml凝胶的上样量进行上样；

(3)再用5倍柱体积的PBS平衡液平衡protein L凝胶层析柱；

(4)用含有半胱氨酸的洗脱体系进行蛋白洗脱，并收集洗脱液；

(5)将洗脱体系轻微混匀后，立即利用NaOH溶液将洗脱体系中和至pH为8.5±0.3；