[发明专利]一种超低温脱除建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的方法

权利要求书

1.一种脱除建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、以感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的苗龄为6周的蝴蝶兰组培苗为对象，在超净工作台的条件下，在体视显微镜下取1.0-1.5cm大小的茎尖；茎尖放入在预培养基在黑暗条件下进预培养1-3天，所述预培养基为BM培养基+0.6M蔗糖，每升所述的BM培养基包括以下组分：花宝1号3g、乙二胺四乙酸铁钠10ml、有机物10ml、蛋白胨1.5g、蔗糖30g、琼脂7g，pH值为6.0，所述乙二胺四乙酸铁钠通过以下方法制备所得：3.67g乙二胺四乙酸铁钠溶于1000ml蒸馏水，制备得到乙二胺四乙酸铁钠溶液；有机物通过以下方法制备得到：将甘氨酸0.1-0.3g、硫胺素0.8-1.2g、盐酸吡哆醇0.05-0.15g、泛酸钙0.05-0.15g、肌醇8-12g混合溶解于1000ml，制备得到有机物；

步骤2、在室温条件下用加载液加载茎尖，所述加载液为BM+2M甘油+0.4M蔗糖；加载液用量为20-30ml，加载液加载茎尖的时间为20-30分钟；

步骤3、0℃条件下用PVS2玻璃化溶液处理茎尖，处理时间为40-50分钟，处理完毕后，用移液枪吸取PVS2溶液在铝箔纸上制作小滴，再将茎尖逐个放进小滴，用镊子将携带茎尖的铝箔纸夹住，投入液氮中进行超低温处理，超低温处理时间为25-35分钟，所述PVS2玻璃化溶液为：MS+30％甘油+15％乙二醇+15％DMSO+0.4M蔗糖；所述PVS2玻璃化溶液的用量为20-30ml；

步骤4、夹起超低温处理后的茎尖，放入卸载液进行卸载；处理完的茎尖放入再生培养基，暗培养7天，再转入正常光照下进行培养；3个月后，茎尖顺利成苗，所述再生培养基为BM+GA₃2.0 mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中的卸载液为BM+1.2M蔗糖；卸载时间为25-35min。