[发明专利]一种超低温脱除建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的方法

说明书

本发明公开了一种脱除建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的方法，包括以下步骤：以感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的蝴蝶兰组培苗为对象，在体视显微镜下取茎尖；茎尖放入在预培养基进预培养；用加载液加载茎尖；用冰冻保护液处理茎尖；将冰冻保护液处理后的茎尖投入液氮中进行超低温处理；将超低温处理后的茎尖放入卸载液进行卸载；处理完的茎尖放入再生培养基，再转入正常光照下进行培养；3个月后，茎尖顺利成苗。本发明能够提高茎尖成活率和再生率。

技术领域

本发明属于脱毒技术领域，具体地说，涉及一种超低温脱除建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的方法。

背景技术

目前已报道侵染蝴蝶兰的病毒有25种，其中建兰花叶病毒(Cymbidium mosaicvirus,CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringsopot virus,ORSV)发生最普遍、危害最严重。长期的无性繁殖导致蝴蝶兰体内病毒不断积累，缺乏有效防治两种病毒的侵染和传播方法使蝴蝶兰普遍感染病毒，这已成为影响蝴蝶兰种苗质量的瓶颈问题之一。世界多国包括我国各地均报道蝴蝶兰种苗感染两种病毒的情况及其普遍。建兰花叶病毒引起蝴蝶兰叶片和花瓣出现褪绿条纹或坏死斑点，抑制植物生长；齿兰环斑病毒引起蝴蝶兰植物叶片产生黄化条斑或黄绿斑驳的嵌纹、花瓣无法展开或色素不均、局部坏死。两种病毒常复合侵染，危害更甚，严重影响蝴蝶兰的生长状况，降低其市场价值。据报道，两种病毒造成的系列影响已对中国台湾省蝴蝶兰产业造成重创。国际上已经认识到这两种病毒的危害，多数国家现已推行了种苗检疫证书制度，严格规定进口蝴蝶兰不能携带这两种病毒，这导致了相当大数量的蝴蝶兰种苗出口受阻。

植株一旦感染病毒则无法根治，因此栽培无毒苗是目前生产上防治病毒的有效方式，生产脱毒苗是目前生产上防治病毒的有效方式，对蝴蝶兰产业至关重要。建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的脱毒研究目前均采用传统脱毒方法，其中广泛采用的方法是化学药剂结合分生组织培养。这种方法存在以下三点弊端：①化学药剂对植物具有毒害作用。研究结果表明，药剂浓度较低，处理时间较短，对植物毒害作用不大，但病毒脱除效率低；药剂浓度较高，处理时间较长，病毒脱毒效率高，但对植物产生很大的毒害作用甚至引起植物死亡。②化学药剂易引起种苗遗传变异。已有研究表明，在培养基中添加化学药剂易引起植物种苗发生遗传变异，而现实生产中又缺乏对于脱毒苗进行相关的遗传稳定性鉴定，导致脱毒存在很大风险，这对于产业来说将造成无可挽回的损失。③分生组织过小极易引起褐化。为了避免药剂对植株产生毒害，研究者常降低化学药剂的浓度，而剥取较小的分生组织。众所周知，分生组织的大小与再生率成正相关，而与脱毒率成负相关。对于蝴蝶兰而言，面临所取分生组织过小极易引起褐化的难题，分生组织小于1mm以下褐化率和死亡率均为100％。

超低温脱毒技术是在超低温保存技术上延伸出来、目前发展迅猛的一种新型脱毒技术，指将感染病原体(病毒、植原体、细菌)的材料经液氮短暂处理后脱除病原体。据国内外学者报道，超低温脱毒技术已在13种植物上有所应用，成功脱除了23种病毒、3种植原体和1种细菌。超低温脱毒技术只使用液氮作为处理手段，不使用任何化学药剂，避免了对植物的毒害问题，液氮保存作为一种常规的种质资源保存手段已被证实再生植株是遗传稳定的，而且与常规分生组织脱毒不同，超低温脱毒技术的脱毒效率与分生组织大小无关，因此不用取过小的分生组织。

目前超低温脱毒技术尚未应用于建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒。

发明内容

有鉴于此，本发明针对建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒常用脱毒技术中剥取茎尖过小、易褐化、化学药剂对植株有毒害作用和易引起变异等弊端，以安全、有效的超低温疗法为技术核心，提供了一种脱除建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种脱除建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的方法，包括以下步骤：

步骤1、以感染建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的蝴蝶兰组培苗为对象，在超净工作台的条件下，在体视显微镜下取1.0-1.5cm大小的茎尖；茎尖放入在预培养基进预培养；

步骤2、在室温条件下用加载液加载茎尖；