[发明专利]检测植物中茉莉酸含量以及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的酶联免疫吸附分析方法

权利要求书

1.一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤一：免疫原和包被抗原的制备；

步骤二：单克隆抗体的制备；

步骤三：建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)；

步骤四：ELISA对植物样品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的测定。

2.根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的免疫原和包被抗原的制备具体步骤为：

由于茉莉酸分子上有羧基，故可通过碳二亚胺法直接将茉莉酸与载体蛋白相连，将茉莉酸（JA），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），二环己基碳二亚胺（DCC）一同溶于二甲基甲酰胺中（DMF），充分活化，低温离心取上层清液，后将上清缓慢加入到牛血清白蛋白即BSA或卵清白蛋白即OVA中，充分反应后，离心取上层清液，透析，冷冻干燥，保存待用，投料比n(JA)=n(NHS)=n(DCC)，小分子与载体蛋白的比值在20~70，其中，JA-BSA为免疫原，JA-OVA为包被抗原

。

3.茉莉酸（JA）

根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的单克隆抗体的制备具体步骤为：

免疫：第一次免疫，将免疫原溶于生理盐水中，再与等体积的福氏完全佐剂混合，皮下多点免疫BALB/C小鼠，每只小鼠免疫原剂量在50~100 μg；两周后第二次免疫，将福氏完全佐剂换成福氏不完全佐剂，其余步骤相同；两周后第三次免疫，重复第二次免疫操作，后一周，尾部取血ELISA检测抗血清效价；取血两周后第四次免疫，重复第三次免疫步骤并取血测效价；取血两周后最后一次腹腔加强免疫，不加佐剂；

融合：腹腔加强免疫三天后取小鼠脾脏，将脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）按5:1~10:1的比例混合，在50%聚乙二醇4000的作用下融合，杂交瘤细胞用HAT培养液混悬，加入预先含有饲养细胞的96孔培养板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养；

筛选：融合后2周左右，用间接ELISA法筛选，将阴性孔无色或接近无色，而阳性孔明确显色的细胞用有限稀释法进行亚克隆2-3次，及时进行检测；

单克隆抗体的大量生产：腹腔注射福氏不完全佐剂致敏BALB/C小鼠，7-10天后腹腔接种杂交瘤细胞，观察小鼠腹水情况，待腹水尽可能多，濒于死亡之前，收集腹水，多次离心取澄清腹水即作为单克隆抗体，单抗与甘油以及磷酸缓冲溶液（PB）4：5：1混合并置于-20℃保存。

4.根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的建立测定茉莉酸甲酯的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)具体步骤为：

优化多个实验条件，在最佳条件的基础上，绘制出标准曲线，结果表明，该单克隆抗体对茉莉酸甲酯（MeJA）的特异性以及灵敏度（IC50）优于对茉莉酸（JA），在此发现上建立了以单克隆抗体为基础以茉莉酸甲酯（MeJA）为实际检测对象的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。

5.根据权利要求1所述的一种检测植物中茉莉酸（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯（JAs）总含量的酶联免疫吸附分析方法（ELISA），其特征在于，所述的ELISA对植物样品中茉莉酸的含量及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量的测定的具体步骤为：

①样品提取方法：

本发明根据检测目标物的不同设计了两种不同的样品提取方法，分别用于检测植物样品中的茉莉酸含量（JA）以及茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（JAs），但是最终都是以茉莉酸甲酯（MeJA）的形式作为被检测对象；

检测植物中茉莉酸含量（JA）的提取方法，只提取茉莉酸（JA），然后将其甲基化变成茉莉酸甲酯（MeJA）：参考NY/T 2871-2015方法并稍作修改，新鲜植物材料(0.5 g)剪碎后于2mL预冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小时，（然后加入一定的JA标准溶液，形成一系列加标样品）离心后，残渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）复提2小时，再次离心取上清，合并上清液，用甲酸调节pH至2.5-3.0，后上Sep-Pak C18小柱(Waters, Milford, USA)，上柱前用2mL 20%甲醇水溶液（甲醇-水：20-80，v/v）活化平衡小柱，上样后按以下步骤：①用2mL 1%甲酸水溶液（1 mL甲酸加水至100 mL）淋洗；②用2mL甲醇淋洗；③用2mL 0.5%氨水甲醇（0.5 mL NH4OH加甲醇至100mL）洗脱两次，收集洗脱液，洗脱液中加入重氮甲烷将提取物茉莉酸（JA）甲基化10分钟获得茉莉酸甲酯（MeJA），然后将其均分成两部分，分别用于ELISA和HPLC分析，室温下氮气吹干，其中一份复溶于0.2mL甲醇，再用PBS稀释，用于ELISA；另一份用1mL甲醇复溶，直接用于HPLC分析；

检测植物中茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（JAs）的提取方法，同时提取茉莉酸（JA）和茉莉酸甲酯（MeJA），然后将其中的茉莉酸（JA）甲基化变成茉莉酸甲酯（MeJA）：新鲜植物材料(0.5 g)剪碎后于2mL预冷的80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）中4℃下浸提16小时，离心后，残渣中再次加入80%甲醇水溶液（甲醇-水：80-20，v/v）复提2小时，再次离心取上清，合并上清液，提取液中加入重氮甲烷将提取物中的茉莉酸（JA）甲基化10分钟使得其中茉莉酸和茉莉酸甲酯均以茉莉酸甲酯（MeJA）的形式存在，然后将其均分成两部分，分别用于ELISA和HPLC分析，室温下氮气吹干，其中一份复溶于0.2 mL甲醇，再用PBS稀释，用于ELISA；另一份用1mL甲醇复溶，直接用于HPLC分析；

HPLC测定条件为：色谱条件: C18 柱 (4.6mm×250mm, 5μm)，流动相为乙腈：0.2%三乙胺水溶液（用磷酸调节pH至4）=60:40 （v/v）；流速为0.8 mL/min；进样量为10 μL；紫外检测波长为210nm；柱箱温度为35℃；在10分钟左右出峰；

②实际样品的检测并与HPLC比较：

选择了一系列样品，根据两种样品提取方法，分别对植物中茉莉酸含量（JA）和茉莉酸和茉莉酸甲酯总含量（JAs）进行测定，并将ELISA结果与HPLC进行比较；

③加标回收实验：

为了进一步证明本方法的实用性和准确性，本发明进行了一系列加标实验，检测茉莉酸（JA）的加标回收率，加标回收结果与HPLC进行对比。