[发明专利]海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用

说明书

本发明公开了海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止序列及其鉴定方法与应用，属于微生物核酸代谢酶技术领域。所述终止序列含有至少一个ATCTGT序列单元。鉴定方法为将外源基因插入载体的多克隆位点处，并将所述载体中的启动子序列替换为Syn5启动子序列，获得重组载体；将该重组载体进行体外转录，回收全长转录的RNA以外的RNA产物并进行3’RACE测序，对应的终止序列均含有至少一个ATCTGT序列单元，即得到噬菌体Syn5RNA聚合酶转录终止序列含有至少一个ATCTGT序列单元。所述转录终止序列可应用于RNA合成生物学。本发明鉴定了海洋噬菌体Syn5的单亚基RNA聚合酶转录终止子，弥补了当前对Syn5RNA聚合酶转录特性研究的不足，鉴定了一个当前最简化造成聚合酶体外转录终止的序列单元。

技术领域

本发明属于微生物核酸代谢酶技术领域，具体涉及海洋噬箘体Syn5的RNA聚合酶终止子及其鉴定方法与应用。

背景技术

RNA(核糖核酸)聚合酶是以RNA或DNA(脱氧核糖核酸)为模板利用三磷酸核苷作为底物合成RNA的酶，是RNA的合成工具。RNA是遗传信息传递的载体，广泛存在于真核生物、原核生物、部分病毒及类病毒中，具有许多种类和功能。除以往熟知的三大类RNA：mRNA、rRNA以及tRNA外，近年来研究发现一些新颖的RNA如microRNA(miRNA)(Mohr and Mott.,2015)、long non-coding RNA(lncRNA)(Dey et al.,2014)、Circular RNAs(circRNA)(Memczaket al.,2013)等都在不同生理过程中发挥着关键作用。随着RNA相关研究的不断深入，RNA在疾病治疗方面的应用价值也日益彰显。通过设计mRNA序列进行体外合成后递送到细胞内可以翻译为任意目的蛋白质，并且mRNA翻译快速，会在体内自动降解，相较于DNA的优势在于不会整合到宿主基因组，且起效更快。除了用作疫苗，mRNA药物也可作为蛋白质药物补充或替代疗法，治疗其它多种疾病。当前，mRNA修饰和制剂等技术也取得了巨大突破，解决了mRNA的稳定性和递送问题，这使得mRNA药物成为一种非常理想的药物形式，mRNA制药行业也日渐成熟，Moderna、BioNTech和CureVac等制药公司都已形成丰富的mRNA药物产品线。除mRNA外，利用双链RNA对目的基因进行RNA干扰(RNAi)以及利用gRNA指导的基因编辑(CRISPR gRNA)技术等都在疾病治疗中有着较好的前景。

RNA相关研究和应用的开展对RNA体外制备提出了很高的挑战，而传统化学合成方法仅限于合成几十个核苷酸以下的长度，当长度增加成本也急剧上升。然而设计用来编码蛋白质的mRNA通常达到几千个核苷酸，显然这一方法不再适用，只能依靠RNA聚合酶进行体外转录来合成RNA。虽然RNA聚合酶种类繁多，但大多数生物体的RNA聚合酶都具有复杂的亚基组成和调控机制，不适合用作RNA的体外合成机器。上世纪70年代科学家们发现一种来自大肠杆菌T7噬菌体的单亚基RNA聚合酶，其结构简单具有专一性转录(识别特异的启动子)和转录效率高等特点，在1984年被一次克隆后就广泛用于RNA的体外合成、重组蛋白的表达(细菌高表达系统)等(Davanloo et al.,1984)，成为体外合成长链RNA的唯一方法，在生物化学研究和RNA合成领域有着广泛的应用。后续发现的噬菌体T3RNA聚合酶以及SP6 RNA聚合酶都与T7 RNA聚合酶亲缘关系较近且具有相似的性质，随着RNA体外合成应用的不断发展和深入，这类单亚基RNA聚合酶都显现出许多不可忽视的缺点，包括产物末端不均一、对起始碱基有较强的偏好性、掺入修饰核苷酸效率低，转录富含高级结构RNA会产生许多中断产物等等(Lyakhov et al.,1998；Chamberlin and Ring,1973)，导致很多情况下合成的RNA无法满足后续研究和应用的要求。