[发明专利]一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法及应用

权利要求书

1.一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，其特征在于，所述方法为利用CRISPR/Cas9系统构建Slco1b2基因敲除大鼠，所述方法包括以下步骤：

1)Slco1b2敲除靶点的选择；

2)sgRNA与Cas9 mRNA的体外合成与转录；

3)将所述Slco1b2基因的sgRNA与Cas9 mRNA共注射到体外的受精卵胞浆中，移植至假孕母鼠中，获得F0代大鼠；

4)对步骤3)获得的F0代大鼠进行基因型鉴定，筛选获得在Slco1b2敲除靶点附近发生非3整数倍缺失的F0代大鼠；

5)将步骤4)筛选获得的F0代大鼠与野生型大鼠合笼，获得F1代大鼠；

6)F1代大鼠之间交配，获得Slco1b2基因纯合敲除的F2代大鼠，构建得到Slco1b2基因敲除大鼠种群。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述Slco1b2基因敲除靶点序列如SEQ ID NO.1所示的5’-GCAAACAAGGTTCTGCGA-3’。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述sgRNA模板是由T7启动子序列和18bp靶点序列组成的长为60bp的Oligo片段；在体外合成该片段后，以其为模板，通过重叠PCR反应合成完整的sgRNA双链模板，并将双链模板提取分离，然后用T7体外转录试剂盒将sgRNA双链模板在体外进行转录，将转录产物提取分离，得到Slco1b2基因的sgRNA；

其中，包含Slco1b2基因敲除靶点的Oligo片段序列为：如SEQ ID NO.2所示的5'-GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAAACAAGGTTCTGCGAGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，其中，所述sgRNA和Cas9mRNA的浓度比为1：2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，F0代大鼠基因型鉴定：提取经所述步骤3)共注射的受精卵发育形成的F0代大鼠基因组DNA，设计针对Slco1b2基因靶点附近序列的引物，进行特异性扩增，然后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，鉴定基因具体的突变情况；

其中，所述Slco1b2基因靶点附近序列如SEQ ID NO.14所示；

其中，所述针对Slco1b2基因靶点附近序列的引物为：

如SEQ ID NO.3所示的上游引物CAGGGTAGACGACCATT；

如SEQ ID NO.4所示的下游引物CTTTCTGCCAGGTGTTTT。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述扩增产物长度为631bp；所述特异性扩增反应的退火温度为56℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤7)：脱靶效应检测；选取脱靶位点，针对所述脱靶位点附近的基因序列设计特异性扩增引物，然后通过对PCR反应产物进行T7EI核酸内切酶切割，验证所述脱靶位点是否发生突变。