[发明专利]一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法，利用CRISPR/Cas9系统进行Slco1b2基因敲除大鼠的构建，包括Slco1b2敲除靶点的选择、sgRNA与Cas9mRNA的体外合成与转录、假孕母鼠的准备、单细胞胚胎的体外显微注射与移植、大鼠繁殖与筛选及得到纯合子Slco1b2基因敲除大鼠。经过T7EI核酸内切酶验证，通过本发明方法制备得到的基因敲除大鼠没有脱靶现象的产生，且在4周左右的F2代敲除大鼠中，总胆红素、直接胆红素和间接胆红素含量均显著性高于野生型大鼠。本发明还提出了将所述构建方法用于高胆红素血症疾病研究及药物研发中的应用。本发明为研究治疗胆红素升高等疾病研究提供了有效方法，为药物研发提供了有效实验工具，具有广泛应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种Slco1b2基因敲除大鼠的构建方法及应用。

背景技术

有机阴离子转运多肽(OATPs)是由可溶性载体(Solute Carrier,SLC)基因编码的12次跨膜蛋白，介导着重要的内源性物质和外源性药物进入细胞。OATPs包含6个亚家族，其中OATP1B亚家族发挥着至关重要的作用，OATP1B亚家族包含OATP1B1和OATP1B3两个家族成员，分别由SLCO1B1(SLC21A6)和SLCO1B3(SLC21A8)基因编码，主要表达在肝脏组织及一些肿瘤组织中。OATP1B1和OATP1B3的底物涵盖范围非常广泛，包括胆红素、胆汁酸、甾体类激素等内源性物质，以及临床上常用的调节血脂、降血栓的他汀类药物，降血压的沙坦类药物以及紫杉醇等抗肿瘤药物。

由于大多数药物需要进入肝脏才能被肝细胞代谢，因此由吸收转运体OATP1B1和OATP1B3介导的吸收速率是药物总清除率的一个决定因素。OATP1B1和OATP1B3的活性被抑制，会改变药物的血药浓度，继而产生严重的不良反应。现临床上已报道多个将环孢霉素与他汀类药物连用时产生强烈肌肉毒性的病例。2017年FDA(US Food and DrugAdministration)发布的“体外由代谢酶和转运体介导的药物-药物相互作用”指导原则中提出，在新药研发过程中，必须要考虑到由OATP1B1和OATP1B3介导的药物-药物相互作用。

胆红素作为OATP1B1和OATP1B3的底物，其体内生物转化过程依赖于OATP1B1和OATP1B3的功能，如果两种转运体的功能活性降低或者丧失，会使血液中胆红素含量升高而引起高胆红素血症。罗氏综合征(Rotor syndrome)是高胆红素血症中的一种，它是一种常染色体隐性遗传病，症状表现为体内OATP1B1和OATP1B3的活性丧失引起的总胆红素和结合胆红素含量升高。

由于伦理学原因，许多科学实验无法在人体中进行，需要借助一定的动物模型来模拟、外推人体的情况。最常见的疾病动物模型和药理实验动物模型是啮齿类的小鼠和大鼠。其中，已有的模拟高胆红素血症的动物模型可以分为两类：一类是向大鼠新生鼠体内注射胆红素或者药物，引起大鼠体内胆红素含量升高，此种方法构建的模型胆红素升高是暂时性的，大鼠体内胆红素含量变化大、存留时间短，不能很好的模拟高胆红素持续损害的过程，且对大鼠新生鼠进行注射的操作难度大，不易成功；另一类是基因敲除模型，已有的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因敲除小鼠模型可以较好的模拟高胆红素血症，但是模型死亡率非常高，不利于后续的治疗研究。

由OATP1B1和OATP1B3的活性丧失引起的Rotor syndrome是一种相对较轻微的高胆红素血症，若能构建这样一种Rotor syndrome的疾病模型，那么它可以稳定地表现出胆红素偏高的疾病状态，将为治疗高胆红素血症提供一种有效的实验工具。已有的Slco1b2(与人中SLCO1B1/SLCO1B3同源)基因敲除小鼠模型是基于传统的同源重组的原理，操作复杂，效率低下，实验周期长，而且花费较高。由于大鼠胚胎干细胞难获得、难培养等技术限制，目前还没有关于Slco1b2基因敲除大鼠模型的报道。