[发明专利]一种共价环状闭合单链RNA在三阴乳腺癌试剂盒中的应用

权利要求书

1.一种检测共价环状闭合单链RNA表达水平的试剂在制备用于三阴乳腺癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于；所述共价环状闭合的单链RNA为小分子非编码环状，来源于KIF4A基因的外显子区域，所述共价环状闭合的单链RNA在三阴性乳腺癌组织中高表达；

所述共价环状闭合的单链RNA序列为：

GTATTAATATTAACCGAGGCCTCCTATGCTTGGGAAATGTAATCAGTGCTCTTGGAGATGACAAAAAGGGTGGCTTTGTGCCCTACAGAGATTCCAAGTTGACTCGACTGCTTCAAGATTCTCTAGGAGGTAATAGCCATACTCTTATGATAGCCTGTGTGAGTCCTGCTGACTCCAATCTAGAGGAAACATTAAATACCCTTCGCTATGCTGACAGAGCAAGAAAAATCAAGAACAAACCTATTGTTAATATTGATCCCCAGACAGCTGAACTTAATCATCTAAAGCAACAGGTACAACAGCTACAAGTCTTGTTGCTACAGGCCCATGGAGGTACCCTGCCTGGATCTATAAC。

2.如权利要求1所述的一种检测共价环状闭合单链RNA表达水平的试剂在制备用于三阴乳腺癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒包括：

Trizol、三氯甲烷、异丙醇、水、逆转录缓冲液、氯化镁、三磷酸碱基脱氧核苷酸、RNA酶抑制剂、酶、circKIF4A特异性PCR引物、β-actin特异性PCR引物、实时定量PCR缓冲液、Taq聚合酶、环状RNA逆转录引物、β-actin特异性逆转录引物；

所述水为无酶水、DEPC水或双蒸水中的一种或几种组合物，所述酶为MMLV逆转录酶或AMV酶。

3.如权利要求2所述的一种检测共价环状闭合单链RNA表达水平的试剂在制备用于三阴乳腺癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于，试剂盒包括：

异丙醇100ml、三氯甲烷100ml、Trizol 50ml、DEPC水或无酶水 10ml、双蒸水10ml、5×逆转录缓冲液1ml、25mM氯化镁1ml、10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸1ml、5U/μl RNA酶抑制剂500μl、200U/μl MMLV 逆转录酶50μl或25U/μl AMV酶50μl、0.2×实时定量 PCR缓冲液2ml、5U/μl Taq 聚合酶50μl、5μM circKIF4A特异性PCR引物50μl、5μM β-actin特异性PCR引物30μl、10μM 环状RNA逆转录引物20μl、10μM β-actin特异性逆转录引物20μl。

4.如权利要求2或3中任意一项所述的一种检测共价环状闭合单链RNA表达水平的试剂在制备用于三阴乳腺癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于：所述circKIF4A特异性PCR引物为：

正向引物为5′-GAGGTACCCTGCCTGGATCT-3′

反向引物为5′-TGGAATCTCTGTAGGGCACA-3′；

所述β-actin特异性PCR引物为：

正向引物为5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′

反向引物为5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

5.如权利要求2或3中所述的一种检测共价环状闭合单链RNA表达水平的试剂在制备用于三阴乳腺癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于：circKIF4A进行逆转录使用转录试剂盒和逆转录特异性引物。

6.如权利要求2或3所述的一种检测共价环状闭合单链RNA表达水平的试剂在制备用于三阴乳腺癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于：20μL逆转录反应的体系如下：

逆转录程序：16℃ 30分钟，42℃ 30分钟，85℃ 10分钟。

7.如权利要求2或3中所述的一种检测共价环状闭合单链RNA表达水平的试剂在制备用于三阴乳腺癌预后预测试剂盒中的应用，其特征在于：所述共价环状闭合的单链RNA特异性实时定量 PCR中，20μL反应体系如下：

共价环状闭合的单链RNA实时定量PCR反应程序：95℃ 3分钟，40个循环，95℃ 12秒，62℃ 35秒，使用SYBR-Green染料进行实时定量PCR扩增。