[发明专利]一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法

说明书

本发明涉及一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明涉及一种来源于地衣芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis）的碱性蛋白酶编码基因。其基因序列为序列表中的SEQ ID NO.2。利用该基因构建的重组微生物表达产生的重组碱性蛋白酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。利用本发明获得的碱性蛋白酶构建重组菌，可实现碱性蛋白酶的高效生产，具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种嗜碱性蛋白酶基因工程菌及其构建方法，属于酶工程和基因工程领域。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。按其水解多肽的方式，可以将其分为外肽酶和内肽酶。

在工业酶中，蛋白酶是最重要的酶之一，约占酶总销售量的60%，其中碱性蛋白酶占有将近40%。与其它蛋白酶对比，碱性蛋白酶在酶活力、耐热、耐碱等方面性质都较强，并且具有酯酶的特性。正因这些优势使得碱性蛋白酶在食品加工、制药、洗涤剂领域和皮革工业有广泛的应用，此外，碱性蛋白酶的其它应用包括例如照相工业中的银回收，角蛋白残留物处理，隐形眼镜清洗，生物膜去除和脱胶。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜碱性蛋白酶及其基因工程菌的构建方法。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种嗜碱性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

编码所述嗜碱性蛋白酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述蛋白酶是由地衣芽胞杆菌中分离获得，所述的地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）BL236，其已于2018年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018539，地址为武汉大学。其具体的分离筛选过程以pH 12为筛选条件对富含蛋白质的样本中微生物进行分离培养并发酵后评价其蛋白酶表达水平，鉴定产酶水平最高的分离物所属种属。

本发明的另外一个目的是提供了一种碱性蛋白酶基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1）将上述获得的分离物染色体基因组上相关基因进行解析，并克隆表达疑似基因，筛选获得产酶水平最高的目标基因；

2）将嗜碱性蛋白酶基因克隆到重组表达载体；

3) 将重组表达载体转化到宿主细胞中。

所述的重组表达质粒为pHY-WZX、pND-113中的任意一种，其中优选重组表达质粒载体为pND-113。

所述的宿主细胞是细菌，为是大肠杆菌或枯草芽胞杆菌。

所述大肠杆菌主要包括：E.coliJM109、E.coli BL21(DE3)、E.coli DH5α、E.coliJM109(DE3)、E.coliW3110中任意一种。

所述枯草杆菌为WB600。

本发明的优点在于：

利用本发明获得的碱性蛋白酶具有良好的pH稳定性，在37℃、pH12.0的缓冲液中保温1h后还有90%以上的酶活，编码基因构建重组微生物，可实现碱性蛋白酶的高效生产，摇瓶发酵60h后，重组碱性蛋白酶摇瓶发酵活力达到575U/mL，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1重组碱性蛋白酶摇瓶发酵产酶曲线。