[发明专利]一种海洋微生物环糊精葡萄糖基转移酶的固定化方法

说明书

本发明提供一种海洋微生物环糊精葡萄糖基转移酶的固定化方法，属于生物技术领域，发明采用分子筛SBA‑15进行吸附‑交联‑包埋复合固定化，固化条件为酶浓度2U/ml、分子筛浓度2g/L、戊二醛浓度0.01％、吸附时间6h、交联时间5h、CaCl₂浓度4％、硬化时间1h。本发明方法对海洋微生物环糊精葡萄糖基转移酶固定化后，酶稳定性好，操作简单，重复使用性好，催化效率高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶固定化方法。

背景技术

环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase,EC2.4.1.19)属于α-淀粉酶第13家族－糖基水解酶家族，和这个家族其它成员一样，CGTase能够催化水解反应，将长链淀粉糖苷键断裂，然后与水发生反应，生成新的还原糖。CGTase是一种多功能酶，除了具有水解活性外，还能催化环化反应、耦合反应和歧化反应。CGTase作为一种生物催化剂，工业上主要用来生产环糊精，在其他领域也有应用。早在上世纪90年代，人们就利用了CGTase耦合与歧化活性，将葡萄糖基连接至橘皮苷上。自此，CGTase的转糖基活性的研究越来越多。如，将糖基接于L-抗坏血酸的C2位上，得到VC衍生物2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)，是迄今人们发现的最稳定、性能最佳的VC替代品。橙皮甙与低聚糊精经CGTase作用，生成的α-葡萄糖基橙皮甙水溶性大大提高，而且产品无毒、无臭无味，可以再水解成橙皮甙和葡萄糖，也可用于食品、医药、化妆品等诸方面。

固定化酶技术是一项生物工程技术，在20世纪60年代首次被提出，是用固定化材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术，与游离酶相比，固定化酶具有多种优势，如酶的稳定性增强，易于从反应系统中分离出来，可重复使用等，因此一直是研究的热点问题。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法，化学方法包括共价结合法等，但固定化酶的应用存在诸多问题，如物理吸附法中酶与载体相互作用力弱，酶易脱落，反复利用性差，共价结合法固定化过程反应比较激烈，容易造成酶的失活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种吸附交联包埋固定化酶的制备方法，该方法结合了物理方法和化学方法，具有工艺简单，成本低，固定化酶稳定好，可重复利用，催化效率高等特点。

本发明提供的一种海洋微生物环糊精葡萄糖基转移酶的固定化方法，包括以下步骤：(1)选择分子筛SBA-15作为固定化吸附载体；

(2)将酶粉溶解于缓冲液中制成酶溶液，并与固定化吸附载体SBA-15混合，振荡吸附；所述酶为海洋微生物Y112环糊精葡萄糖基转移酶；

(3)加入戊二醛溶液至(2)得到的溶液中，振荡交联；

(4)加入海藻酸钠至(3)得到的溶液中，用注射器逐滴滴入CaC1₂溶液中硬化，抽滤获取固定化酶凝胶珠，用蒸馏水多次冲洗至无CaC1₂残留。

进一步，根据本发明所述的固定化酶制备方法，步骤(2)中酶与固定化吸附载体进行吸附的温度和转速分别为16℃、150r/min，吸附时间为6h，酶液浓度2U/mL。

进一步，所述步骤(3)中酶与固定化吸附载体进行交联的戊二醛溶液的终浓度为0.01％，交联时间5h，交联温度和转速分别为16℃、150r/min。

进一步，所述步骤(4)中海藻酸钠溶液的终浓度为0.04g/mL，CaC1₂溶液的终浓度为4％，硬化时间1h。

本发明与现有技术相比的有益效果：

(1)本发明使用吸附交联包埋复合固定化技术，成本较低，反应温和，操作简单；