[发明专利]一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法

说明书

本发明涉及一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术等领域；本发明通过在谷氨酸棒杆菌中表达从头合成岩藻糖基乳糖途径所需的编码GDP‑甘露糖‑6‑脱氢酶、GDP‑岩藻糖合成酶、乳糖通透酶和α‑1,2‑岩藻糖转移酶或α‑1,3‑岩藻糖转移酶的基因，构建重组谷氨酸棒杆菌，以实现2’‑岩藻糖基乳糖或3‑岩藻糖基乳糖的合成；并通过过表达重组谷氨酸棒杆菌中编码磷酸甘露糖异构酶、磷酸甘露糖变位酶和甘露糖‑1‑磷酸鸟嘌呤基转移酶基因，获得岩藻糖基乳糖的高产；本发明方法得到的工程菌可利用葡萄糖或甘油合成岩藻糖基乳糖，具有生长快、安全性高等优势，工业化生产的潜力明显。

技术领域

本发明涉及一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法，属于代谢工程和食品发酵技术等领域。

背景技术

2’-岩藻糖基乳糖（2′-fucosyllactose，2’-FL）和3-岩藻糖基乳糖（3-fucosyllactose，3-FL）是人乳中含量最丰富的一类岩藻糖基低聚糖。研究表明，哺乳阶段和地理区域分布显著影响乳汁中分泌的2’-FL浓度。如经10个国家的435名妇女的调查发现，78%的中国育儿母亲乳汁中含有分泌的2’-FL，而菲律宾仅46%育儿母亲乳汁中含有分泌的2’-FL。目前，美国、欧盟和中国等管理部门已对人乳寡糖的安全性、适用性以及使用剂量等进行规范。

一般人乳寡糖可通过分离纯化或者体外合成法生产。但因其含量低、原料来源不足以及步骤繁琐等问题，无法实现其从母乳中直接分离纯化制备。体外合成人乳寡糖主要包括化学合成法、酶法合成（包括化学-酶法）以及生物法等。其中，化学法需要精确地选择性保护不同羟基以及去保护等反应，过程复杂，副反应和副产物比例高，无法实现高效率合成。目前国内外研究较多的是采用酶法合成（化学-酶法）人乳寡糖。作为化学合成法的有效替代途径，可根据糖基供体与受体的构型筛选合适的酶类，可以减少化学法中存在的严谨的设计保护基团及立体异构性等要求。然而，供体核糖苷价格昂贵，酶催化活性低，每批次合成量仅为毫克级，无法实现规模化和工业化生产的迫切需要。近5年来，利用系统生物学、代谢工程和途径工程等技术手段构建大肠杆菌基因工程菌生产人乳寡糖（特别是2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖）的研究持续受到关注。然而，大肠杆菌发酵过程易积累乙酸等副产物，严重抑制菌体生长、底物转化率和产物产量；另外，大肠杆菌培养过程中需要添加一定浓度的抗生素以及产内毒素等均严重限制了人乳寡糖作为营养强化剂在婴幼儿产品开发和应用的领域。

目前尚未发现有通过重组菌来发酵生产人乳寡糖的报道。

发明内容

本发明的目的是提供高效生产岩藻糖基乳糖的手段。具体的，本发明的目的在于提供一种产岩藻糖基乳糖的重组表达质粒载体、代谢工程菌及生产方法。

本发明公开了一种通过在谷氨酸棒杆菌中表达GDP-甘露糖-6-脱氢酶基因gmd、GDP-岩藻糖合成酶基因wcaG和乳糖通透酶基因lacY，以及α-1,2-岩藻糖转移酶基因futC或α-1,2-岩藻糖转移酶wbgL合成2’-岩藻糖基乳糖，或α-1,3-岩藻糖转移酶futA合成3-岩藻糖基乳糖 （详见图1），并通过强化谷氨酸棒杆菌中编码磷酸甘露糖异构酶（ManA）、磷酸甘露糖变位酶（ManB）和甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶（ManC）基因的表达量，构建而成的高效合成2’-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖的重组谷氨酸棒杆菌及生产方法，为安全高效生产营养强化剂人乳寡糖提供行之有效的解决策略和途径。所构建的重组菌能以葡萄糖和甘油等为底物分别合成2’-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖。