[发明专利]检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法

说明书

本发明属于化学分析领域，提供了检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r‑氨基丁酸含量的方法，取戊四唑致痫的大鼠海马组织，冰上匀浆，离心取上清液进行衍生处理，然后进行高效液相色谱检测谷氨酸及r‑氨基丁酸，色谱条件为：采用反向C18柱，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为40‑60mmol/L的乙酸钠溶液和四氢呋喃，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱。本发明的检测方法步骤简单，结果精确，检测快速。

技术领域

本发明涉及化学分析领域，具体涉及检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法。

背景技术

癫痫是由于神经元异常放电引起的短暂性脑功能障碍，是一种常见的中枢神经系统综合征，癫痫持续状态(SE)是神经内科常见的危重急症，长时间癫痫发作若不及时控制，可因高热、循环衰竭或神经元兴奋毒性损伤，导致不可逆的脑损伤，致残率和病死率很高。SE与癫痫终止机制关系密切，因此，探索癫痫发作终止的相关机制，对改善SE患者预后及其重要。目前，有研究指出，抑制性神经递质及兴奋性神经递质失衡是介导SE的关键。r-氨基丁酸(GABA)与谷氨酸(GLU)分别为中枢神经系统中最为重要的抑制性及兴奋性神经递质，两者失衡是导致SE的重要原因之一。GLU对中枢神经系统有兴奋作用，与癫痫的发作起始关系密切，而其代谢产物：GABA，是中枢神经系统抑制性物质，可介导癫痫发作的终止。GLU、GABA的合成及释放与癫痫的终止关系密切。海马作为大脑边缘系统的一部分，与癫痫发作关系密切。因此。研究SE状态下海马内GLU、GABA含量及其比值变化，对癫痫持续状态的发生、发展及其终止有重要意义。

常见的氨基酸检测方法有离子交换色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳、色谱-质谱联用等。近年来，柱前衍生反相高效液相色谱法分析氨基酸的发展非常迅速，该方法具有灵敏度高、分析速度快、衍生试剂种类多样等优点，已经在许多领域得到应用。然而以前的色谱条件相对比较复杂、衍生产物存在不稳定、易降解等缺点，并且成本高。在本实验中我们摸索出了新的色谱条件，实现了脑内海马组织中GLU、GABA快捷、省时、低成本且准确度高的测定目的。

发明内容

本发明目的在于提供一种低成本、方便快捷的检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：检测致痫大鼠海马组织谷氨酸及r-氨基丁酸含量的方法，包括以下步骤：

(1)致痫大鼠模型的建立：取SD大鼠，用剂量为80mg/kg的戊四唑进行皮下注射，观察大鼠行为，根据Racine分级标准，选择IV-V级致痫大鼠作为致痫大鼠模型；

(2)将步骤(1)中得到的所述致痫大鼠达到癫痫发作级别后30min时断头取海马组织，称取海马组织，冰上匀浆，取海马组织匀浆加入50vol％的甲醇溶液，按照每100mg加入1mL甲醇溶液计算，-4℃,12000rpm离心20-30min，取上清与乙腈1:1混合后，-4℃,12000rpm离心20-30min得到的上清液为样品，并将样品进行衍生处理；

(3)衍生后的样品通过高效液相色谱进行检测，测定样品中的谷氨酸及r-氨基丁酸含量，色谱条件如下：

色谱柱采用反向C18色谱柱；

流速：1.0mL/min；

柱温：30-35℃；

检测波长：265nm；

进样量：20uL；

流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为40-60mmol/L乙酸钠溶液和四氢呋喃，二者体积比为99:1，所述乙酸钠溶液用冰醋酸调节pH至4.8，所述流动相B为乙腈；

采用如下梯度洗脱程序：