[发明专利]含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法在审
| 申请号： | 201811073689.5 | 申请日： | 2018-09-14 |
| 公开（公告）号： | CN109022364A | 公开（公告）日： | 2018-12-18 |
| 发明（设计）人： | 王清路 | 申请（专利权）人： | 王清路;许晓松 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867;C12N15/113;C12N15/90 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 255086 山东省淄*** | 国省代码： | 山东;37 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 人造血干细胞 缺陷型 制备 分子生物学技术 造血干细胞分化 流式细胞仪 造血干细胞 测序分析 机体恢复 载体构建 肿瘤免疫 自杀基因 电转 鸟苷 敲除 肿瘤 分化 筛选 研究 | ||
1.一种含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)人造血干细胞CD34+分离与培养
人造血干细胞CD34+分离，纯化，培养；
(2)含HSV-TK基因人造血干细胞CD34+的获得
根据HSV-TK全基因编码区序列人工合成HSV-TK基因，而后构建慢病毒质粒载体，慢病毒质粒载体与包装质粒共转染293T细胞获得HSV-TK慢病毒；然后HSV-TK慢病毒侵染人造血干细胞CD34+，筛选获得含HSV-TK基因的人造血干细胞CD34+；
(3)CTLA4基因敲除载体构建
根据CTLA4基因编码序列设计gRNA target序列，然后将gRNA target序列克隆进表达载体，获得CTLA4基因的敲除载体；
gRNA target序列为5’-ATGCCCAGGTAGTATGGCGG-3；
(4)电转染人造血干细胞
含HSV-TK基因的人造血干细胞CD34+中加入电转液和CTLA4基因的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养；
(5)流式细胞仪筛选与测序分析
电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离得到单克隆细胞，单克隆细胞扩大培养，即得含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞；扩大培养后的单克隆细胞提取基因组进行测序比对分析。
2.根据权利要求1所述的含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，其特征在于步骤(2)中HSV-TK基因的引物如下：
HTF：5’-ATGGCTTCGTACCCCTGCCATCAAC-3’
HTR：5’-TTAGTTAGCCTCCCCCATCTC-3’。
3.根据权利要求1所述的含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，其特征在于步骤(2)中慢病毒质粒载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-TK。
4.根据权利要求1所述的含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，其特征在于步骤(2)中筛选是利用嘌呤霉素进行筛选。
5.根据权利要求1所述的含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，其特征在于步骤(3)中表达载体为pX458。
6.根据权利要求1所述的含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，其特征在于步骤(4)中继续培养时间为48-72h。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于王清路;许晓松，未经王清路;许晓松许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201811073689.5/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
