[发明专利]含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种含HSV‑TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法。人造血干细胞CD34+分离与培养，含HSV‑TK基因人造血干细胞CD34+的获得，CTLA4基因敲除载体构建，电转染人造血干细胞，流式细胞仪筛选与测序分析。本发明制备的含有自杀基因HSV‑TK且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞为进一步研究造血干细胞分化成CTLA4缺陷型T淋巴细胞用于长期肿瘤免疫提供了基础；同时肿瘤在机体内消失后，患者服用丙氧鸟苷就可以清除该类造血干细胞和已分化产生的T淋巴细胞，使机体恢复正常状态。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法。

背景技术

近年来，继化疗、放疗和分子靶向治疗后，免疫治疗逐渐崭露头角。与其他疗法不同的是，免疫治疗尝试利用患者的免疫系统来控制和清除肿瘤。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)又称CD125分子，是一种免疫调节分子，是APC表面B7分子配体，属于免疫球蛋白超家族的抑制分子，其结合后诱导T细胞参与免疫反应负调节，即诱导T细胞无反应，使T细胞的细胞周期停滞于Gl期等，抑制T淋巴细胞的增殖和功能。研究表明，用抗体阻断CTLA4功能可显著增加T淋巴细胞的激活。抗肿瘤T淋巴细胞在机体对恶性肿瘤的免疫监视中起关键作用。实验显示，给移植了肿瘤的小鼠注射抗CTLA4抗体可抵制多种类型的肿瘤并可长期保持抗肿瘤免疫。临床研究表明阻断CTLA4可使肿瘤缩小。这些资料都表明CTLA4在肿瘤的发生发展中起重要作用。

CRISPR/Cas9是第三代基因组编辑技术，可以准确实现各类细胞基因组中某基因的敲除或敲入。利用该技术可以准确地实现T细胞或其他细胞内CTLA4基因敲除，T淋巴细胞膜上CTLA4受体的缺失解除了T细胞繁殖和功能活化的抑制，使T细胞更强的增殖和杀伤靶标(靶细胞)。

无论是CTLA4抗体药物还是CTLA4基因缺陷型T淋巴细胞，都需要不停用于患者才能够持续地杀灭肿瘤细胞直至肿瘤细胞彻底在机体被清除。T淋巴细胞在机体中来自造血干细胞的分化并在脾中成熟，如果机体存在CTLA4基因缺陷型的造血干细胞，那么机体就会持续产生可以用于肿瘤治疗和预防的CTLA4基因缺陷型T淋巴细胞。而当肿瘤细胞在机体消失后，该类CTLA4基因缺陷型造血干细胞就没有在机体存在的必要，所以给该类造血干细胞提前导入HSV-TK自杀基因可以实现在机体肿瘤细胞被清除后，通过丙氧鸟苷诱导机体内造血干细胞“自杀”而达到清除CTLA4基因缺陷型造血干细胞的目的，让机体恢复自然状态。

丙氧鸟苷(GCV)是一种用于抗病毒感染的药物，HSV-TK基因表达的胸苷激酶能将GCV磷酸化成GCV-TP取代DNA合成过程中的鸟嘌呤-5′－三磷酸，成为DNA合成的竞争性抑制剂，抑制DNA链延长，通过诱导凋亡机制引起细胞死亡。HSV-TK/GCV系统介导细胞毒作用中存在不可修复的双链DNA断裂，抑制基因的同源修复能够显著增强HSV-TK/GCV系统的细胞毒作用。所以采用此系统在机体肿瘤细胞消除后，可以清除CTLA4基因缺陷型造血干细胞。

因此，通过构建和包装含有HSV-TK基因的慢病毒然后感染人造血干细胞，而获得含有HSV-TK基因的造血干细胞，然后采用CRISPR/Cas9技术敲除该造血干细胞中的CTLA4基因，从而获得含HSV-TK自杀基因且CTLA4基因缺陷型造血干细胞，为该类干细胞进一步开发利用奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，制备的造血干细胞能够在机体中持续不断地分化成CTLA4基因缺陷型T淋巴细胞，实现肿瘤治疗的长效性。

本发明所述的含HSV-TK基因且CTLA4基因缺陷型人造血干细胞的制备方法，步骤如下：

(1)人造血干细胞CD34+分离与培养

人造血干细胞CD34+分离，纯化，培养；