[发明专利]一种组织修复能力强的脂肪干细胞分离培养及筛选方法

权利要求书

1.一种组织修复能力强的脂肪干细胞，其特征在于：它是具有如下特征的脂肪间充质干细胞：

a、汇合度为80％时，培养上清液中，每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量≥300pg；

b、表达抗原CD10，不表达抗原CD200。

2.根据权利要求1所述脂肪干细胞，其特征在于：所述细胞中，汇合度为80％时，培养上清液中，每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量≥500pg。

3.权利要求1或2所述的细胞的制备方法，其特征在于：取脂肪间充质干细胞，培养，检测细胞汇合度为80％时，培养上清液中每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量，同时检测细胞的抗原CD10、CD200的表达情况，选择具有权利要求1或2所述特征的细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述培养基为含有体积分数为2％-5％的富血小板血浆PRP的DMEM/F12培养基，培养条件为37℃、5％CO₂；所述富血小板血浆PRP按照如下方法制备：取血液，加入柠檬酸钠至0.05～0.15mol/L，置于低温离心机中以4000g离心15min，收集上层液，即为富血小板血浆；优选地，加入柠檬酸钠至0.1mol/L。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述脂肪间充质干细胞按照如下方法制备：

(1)取脂肪组织，进行0.05-1％(w/v)的胶原酶液消化；

(2)取消化后的脂肪组织，离心，得到基质血管组分；

(3)将分离的血管基质组分，加入培养基重悬后进行培养，得到脂肪干细胞；所述培养基为含有体积分数为2％-5％的富血小板血浆PRP的DMEM/F12培养基，所述富血小板血浆PRP按照如下方法制备：取血液，加入柠檬酸钠至0.1mol/L，置于低温离心机中以4000g离心15min，收集上层液，即为富血小板血浆；

(4)脂肪干细胞原代培养至汇合度80％进行消化传代培养，得到脂肪间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述消化是将脂肪组织与消化液按体积比1:1混合，置于37℃恒温摇床中转速50-250rpm消化0.5-4h。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述离心是150-2000g离心5min。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述培养瓶为T75培养瓶；所述培养的条件为：37℃，2-8％CO₂，饱和湿度培养箱中培养，48h后第一次换液，之后每2d换液一次。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，传代扩增比例为1:4-1:5。