[发明专利]一种组织修复能力强的脂肪干细胞分离培养及筛选方法

说明书

本发明公开了一种组织修复能力强的脂肪干细胞分离培养及筛选方法。本发明在脂肪间充质干细胞的基础上，对其表面抗原进一步筛选，选定表达CD10和不表达CD200的细胞，再对其分泌血管内皮生长因子的能力进行筛选，得到一种组织修复能力强的脂肪干细胞。本发明解决了脂肪干细胞异质性问题，筛选出组织修复能力强的脂肪干细胞，具有组织工程上的广泛应用前景。

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，特别涉及一种脂肪干细胞的筛选方法。

背景知识

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞，在胚胎发育、组织更新和损伤修复过程中扮演着关键角色。干细胞是再生医学的基础和灵魂，可以说再生医学诞生和发展取决于干细胞研究的开展和深入。

脂肪干细胞因为具有较强的干性和取材容易的特点，在组织工程研究上使用广泛，同时也具有很大的临床应用前景。然而，由于供者的年龄、健康状况、体内微环境等等因素，脂肪干细胞分泌特定细胞因子水平高低不一，其分化潜能也不一致。

在临床治疗中，用于移植的细胞需要具有较低的异质性，以稳定其修复组织的效果。然而目前尚未见一种异质性较低的脂肪干细胞被报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种组织修复能力强的脂肪干细胞分离培养及筛选方法。

本发明提供了一种组织修复能力强的脂肪干细胞，其特征在于：它是具有如下特征的脂肪间充质干细胞：

a、汇合度为80％时，培养上清液中，每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量≥300pg；

b、表达抗原CD10，不表达抗原CD200。

前述脂肪干细胞，其特征在于：所述细胞中，汇合度为80％时，培养上清液中，每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量≥500pg。

前述的细胞的制备方法，其特征在于：取脂肪间充质干细胞，培养，检测细胞汇合度为80％时，培养上清液中每毫克总蛋白中血管内皮生长因子含量，同时检测细胞的抗原CD10、CD200的表达情况，选择具有权利要求1或2所述特征的细胞。

前述的方法，其特征在于：所述培养基为含有体积分数为2％-5％的富血小板血浆PRP的DMEM/F12培养基，培养条件为37℃、5％CO₂；所述富血小板血浆PRP按照如下方法制备：取血液，加入柠檬酸钠至0.05～0.15mol/L，置于低温离心机中以4000g离心15min，收集上层液，即为富血小板血浆；优选地，加入柠檬酸钠至0.1mol/L。

前述的方法，其特征在于：所述脂肪间充质干细胞按照如下方法制备：

(1)取脂肪组织，进行0.05-1％(w/v)的胶原酶液消化；

(2)取消化后的脂肪组织，离心，得到基质血管组分；

(3)将分离的血管基质组分，加入培养基重悬后进行培养，得到脂肪干细胞；所述培养基为含有体积分数为2％-5％的富血小板血浆PRP的DMEM/F12培养基，所述富血小板血浆PRP按照如下方法制备：取血液，加入柠檬酸钠至0.1mol/L，置于低温离心机中以4000g离心15min，收集上层液，即为富血小板血浆；

(4)脂肪干细胞原代培养至汇合度80％进行消化传代培养，得到脂肪间充质干细胞。

前述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述消化是将脂肪组织与消化液按体积比1:1混合，置于37℃恒温摇床中转速50-250rpm消化0.5-4h。

前述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述离心是150-2000g离心5min。