[发明专利]一种抗体纯化方法

权利要求书

1.一种抗体纯化方法，其特征在于，包括：

步骤一、在M1基因SEQ NO.2中插入表达载体pet32a，得到M1重组蛋白，以所述M1重组蛋白为抗原，免疫动物，再进行细胞融合和亚克隆；将上述亚克隆后的细胞扩大培养并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠体内的腹水，将腹水在–20℃下保存；

步骤二、将腹水置于4℃解冻过夜，取出后4℃条件下，10000×g离心10min，取上清，4℃保存；取腹水，用0.06mol/LpH4.4醋酸缓冲液稀释3倍，用1mol/L HCl调节pH至4.8；按每毫升稀释腹水加11μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h；取出后，4℃条件下，15000×g离心30min，取上清，加入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调pH至7.2，在冰面操作加入饱和硫酸铵至45％饱和度，静置30min；取出后，10000×g离心30min，弃上清，将沉淀4℃保存；

步骤三、将步骤二中的沉淀淀以0.01mol/L pH 7.2PB溶液A重溶，经Sepharose G-25除盐后，过DEAE阴离子层析柱；以含0.5mol/L NaCl的0.01mol/L pH 7.2PB为洗脱液B，A、B液混合进行线性梯度洗脱，收集蛋白峰；提纯样品保存于–20℃环境中。

2.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，还包括：

步骤四、采用间接ELISA法检测纯化后抗体效价。

3.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，在步骤一中，免疫动物在初次免疫后至少加强注射3次。

4.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，所述载体pet32a为SEQ NO.3。

5.根据权利要求1中所述抗体纯化方法，其特征在于，在步骤一中，细胞融合后还包括：

吸取细胞上清100ul/孔进行间接ELISA检测；根据ELISA结果，判断阳性孔；用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次复检，进一步确认阳性孔。

6.根据权利要求5中所述抗体纯化方法，其特征在于，在步骤一种，亚克隆方法包括：

对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆，第一次亚克隆有限稀释阳性孔中细胞，至多个孔中，加HT DMEM培养基培养，7天后在显微镜下观察，间接ELISA检测有克隆生长的孔，取OD值高的孔为阳性孔；挑取阳性孔的细胞进行第二次亚克隆，获取阳性细胞株作为最终制备的单抗细胞，并扩大培养。