[发明专利]一种抗体纯化方法

说明书

本发明实施例提供了一种抗体纯化方法，用M1重组蛋白免疫的动物，对重组蛋白质反应度优于天然蛋白质，能够产生性能稳定、抗原效价高的单抗，采用CA‑AS法进行抗体纯化，抗体回收率、抗体活性、抗体纯度等方面存在较大优势，且此法操作简便，可重复使用，生产成本较低。

技术领域

本发明实施例涉及生物制药技术领域，更具体地，涉及一种抗体纯化方法。

背景技术

当代抗体药物的工艺研发是基于基因工程、细胞工程和发酵工程基础之上的，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞作为主要的哺乳动物细胞表达宿主细胞具有遗传背景清晰、具备翻译后加工能力等特点，成为了蛋白质生产的标准工业化细胞株，同样也适合于抗体蛋白的表达。随着细胞悬浮培养技术的发展，使得大规模培养成为可能，而无血清培养基的应用则使得蛋白纯化工艺更为简便，这一切都大大加速了抗体药物的产业化进程，为制备价廉质优的抗体药物奠定了基础。

自首个单克隆抗体制备以来，在Koehler和Milstein的基础上经过近30年的蓬勃发展，单克隆抗体制备技术在生命科学研究以及医学实践方面做出了巨大的贡献，已成为了现代生物技术支柱产业之一。单克隆抗体药物因其靶向特异性，毒副作用低，治疗的高效性等明显优势在肿瘤自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等领域有重要的应用。抗体药物制造工艺从研发时期的细胞株构建、培养基优化、上游细胞培养、下游纯化到最后制剂这五个方面的任何一个环节都对抗体药物有很重要的影响，其中又以下游纯化工艺最为复杂繁琐，下游工艺含有多个步骤，目前常用的的是亲和层析、离子层析和疏水层析串联使用的方法。虽然目前都采用这种模式，但是每个工艺中细小参数的变化都有可能导致巨大的变异。下游层析工艺中除了要除去HCP、残留DNA和二聚体多聚体等杂质之外还要对上游可能引入的病毒进行去除。

抗体药物生产过程中，亲和层析通常用于抗体的捕获阶段，即第一个纯化工艺步骤，从发酵料液中选择性分离出所需抗体，接着用离子交换层析和/或疏水层析和/或混合模式层析，来进一步精纯亲和层析洗脱下来的抗体。就一般工艺而言，亲和层析洗脱得到的样品通常会进行低pH病毒孵育，并且进行下一步层析前都会对低pH孵育的样品进行处理，以达到不同层析方法需要的操作条件。

传统的阴离子层析前样品的处理，一般都是一步调pH，即直接将低pH孵育的样品回调到阴离子层析上样所需的pH范围。但是该方法可能会导致抗体不稳定，生成沉淀从而造成样品的损失，另外对抗体的杂质去除效果不理想，增加阴离子层析吸附杂质的量，对层析填料造成伤害，缩短其寿命。阴离子交换层析主要是去除细菌内毒素、宿主蛋白和DNA杂质等，常规的方法是采用流穿(flow-through)方式，抗体直接通过柱子，而污染物被吸收抗体药物中杂质的存在会导致药效降低，严重的会导致人体死亡。例如：含有内毒素或被内毒素污染的药物进入人体后会引起多种变态反应，如：高烧、休克、甚至死亡。许多抗体，包括IgG和IgM，均会形成聚集物，聚集物的存在会产生和主产品不同的药效，会造成抗药性抗体的形成。残留的宿主细胞蛋白有可能刺激机体发生免疫应答产生相应的抗体，同样会对人体造成伤害。

发明内容

本发明实施例提供了一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的一种抗体纯化方法。

本发明实施例提供了一种抗体纯化方法，包括：

步骤一、在M1基因SEQ NO.2中插入表达载体pet32a，得到M1重组蛋白，以所述M1重组蛋白为抗原，免疫动物，再进行细胞融合和亚克隆；将上述亚克隆后的细胞扩大培养并注射至小鼠腹腔，7-10日后抽取小鼠体内的腹水，将腹水在–20℃下保存；