[发明专利]一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株

权利要求书

1.一种毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤包括：

将包含α分泌信号肽基因的基因片段，正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，得到α重组载体，其中，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因上游的EcoRI位点和下游的多克隆位点。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因与其上游EcoRI位点之间的Kozak序列。

3.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括:

采用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列为引物扩增毕赤酵母分泌型载体中的α分泌信号肽基因，并经EcoR I酶切，得到带相应黏性末端的所述基因片段,其中，所述多克隆位点为顺次连接的BsmI、AvrII、NotI和EcoRI位点。

4.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤还包括：

采用定点突变法，选择性地对所述α重组载体上的酶切位点进行改造，所述α重组载体上的酶切位点包括位于α分泌信号肽基因内及其上下游的酶切位点。

5.根据权利要求3所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，

所述制备方法的步骤还包括：

采用定点突变法，将所述α重组载体上依次含有EcoRI位点、KozaK序列、α分泌信号肽基因、BsmI位点、AvrII位点、NotI位点和EcoRI位点的且如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列改造为含Kozak序列、α分泌信号肽基因、EcoRI位点、AvrII位点、NotI位点和XhoI位点顺次连接而成的如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，

所述毕赤酵母胞内表达载体为pAO815，所述定点突变法的步骤包括：

对所述α重载体的SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，采用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物，定点突变掉Kozak序列前的EcoRI位点；并采用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示引物定点突变掉α分泌信号肽基因序列中的XhoI位点，同时将α分泌信号肽基因后的BsmI位点突变为EcoRI；以及采用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示引物定点突变掉NotI位点后的EcoRI位点，同时引入XhoI位点。

7.一种毕赤酵母载体，其特征在于，所述载体由权利要求1至6任一项所述毕赤酵母载体的制备方法所制备得到。

8.一种毕赤酵母载体，其特征在于，所述载体包括pAO815质粒除去单克隆位点以外的全长基因和如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

9.如权利要求7或8所述毕赤酵母载体在构建含目的基因且免抗生素筛选的分泌型重组表达载体中的应用，包括：将待表达的目的基因定向插入权利要求7～8任一项所述毕赤酵母载体的多克隆位点。

10.一种重组毕赤酵母菌株，其特征在于，所述重组毕赤酵母菌中含有由权利要求7或8所述的毕赤酵母载体与目的基因构建得到的免抗生素筛选的分泌型重组表达载体。