[发明专利]一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株

说明书

本发明提供一种毕赤酵母载体的制备方法，包括将包含α分泌信号肽基因和多克隆位点的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中。可获得携带α分泌信号肽并具有多克隆位点的毕赤酵母空载体，实现了不同目的基因的定向克隆和在毕赤酵母菌中的蛋白表达与分泌，并免于抗生素筛选。此外，本发明还提供一种毕赤酵母载体，以及应用该载体构建得到的重组毕赤酵母菌株。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株。

背景技术

毕赤酵母是真菌表达体系家族的重要一员，利用它作为宿主进行外源基因的表达已经得到越来越多的应用。目前利用毕赤酵母进行蛋白表达的载体主要分为两大类：胞内表达载体和分泌型载体。其中，典型的胞内表达载体如质粒pAO815，如图1所示，该载体只有1个单克隆位点EcoRI，外源基因插入载体后需要确定正确的插入方向才能进行蛋白的表达，且蛋白表达后无法分泌到培养基中，需要对酵母细胞进行破壁处理再进行收集，增加了工艺步骤和生产成本，此外，由于该载体上存在His4基因，可以与毕赤酵母his4菌株进行互补，为选择毕赤酵母重组菌株提供筛选标记，具体地，在电转化酵母后能整合到酵母的基因组上，只有整合成功的毕赤酵母可以在组氨酸营养缺陷型培养基(如MD平板)上生长，整合到GS115菌株获得的表型为His+Mut+，从而在不需要采用抗生素进行阳性转化子的筛选的情况下获得目的表型菌株。而质粒pPIC9K和质粒pPICZαA均为典型的分泌型表达载体，均携带有α分泌信号肽基因和抗生素标记，其中，α分泌信号肽基因表达的α分泌信号肽是使目的基因表达的蛋白分泌的细胞外的关键；除此之外，与胞内表达载体不同的是，其以抗生素标记作为筛选标记，在质粒电转进入酵母后，抗生素基因即整合到毕赤酵母基因组上，使得该毕赤酵母具有相应的抗生素抗性，因而可以在含特定抗生素的培养基中生长，从而利用该方法可以获得转化成功的毕赤酵母重组菌株，例如，pPIC9K携带有G418(遗传霉素)标记，在表达外源蛋白时需要采用抗生素G418筛选高拷贝表达菌株，但G418价格昂贵，采用G418进行体内筛选高拷贝菌株的成功率较低。而pPICZαA携带博来霉素标记，则需要采用博来霉素进行筛选，但是，博来霉素具有毒性，价格不菲，操作过程需要避光，在实际工业生产中，采用大量的抗生素会增加成本，且存在相应的潜在风险。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种经改造的毕赤酵母载体及其制备方法和应用，该载体携带有α分泌信号肽基因以及便于目的基因定向插入的多克隆位点，能适用不同来源和种类的目的基因的导入，避免了为获得不同分泌型重组载体的反复构建，且在导入目的基因后，能方便获得免抗生素筛选的分泌型高拷贝表达菌株，且简化了操作步骤，降低了生产成本，提高了安全性。

为了实现本发明的目的，本发明首先提供一种毕赤酵母载体的制备方法，其步骤包括：

将包含α分泌信号肽基因的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，得到α重组载体，其中，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因上游的EcoRI位点和下游的多克隆位点，其中，所涉及的酶切位点包括经酶切的相应黏性末端。

可选地，所述基因片段插入所述毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点后获得包含如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的α重组载体。

可选地，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因与其上游EcoRI之间的Kozak序列。

可选地，所述胞内表达载体为pAO815。

可选地，所述多克隆位点为顺次连接的BsmI、AvrII、NotI和EcoRI。

可选地，所述制备方法还包括，采用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示序列为引物扩增毕赤酵母分泌型载体中的α分泌信号肽基因，并经EcoR I酶切，得到带相应黏性末端的所述基因片段。

可选地，所述制备方法的步骤还包括：