[发明专利]一种极化和扩增CD4+T细胞的方法及组合物及在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用

权利要求书

1.一种极化和扩增CD4+T细胞的方法：包括以下步骤：

获取纯化的CD4+T细胞：分离纯化或诱导培育后的CD4+T细胞、CD4+或CD62L+ T细胞；

（2）激活细胞：在培养基中0-24小时内激活步骤（1）中获得的细胞；

（3）培养及细胞增殖：在激活后的第三天，将细胞离心，去上清，并培养于辅以10%胎牛血清，抗生素和100U/mL 白细胞介素-2的培养基中；刺激增值和诱导分化；

（4）取激活末期的细胞并检测，即可。

2.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的细胞来源包括并不限于人源的外周血，脐带血，免疫器官内的血细胞和血前体细胞，癌症侵入淋巴细胞和鼠源的外周血和免疫器官内的血细胞。

3.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中激活细胞的培养基为RPMI-1640辅以10%胎牛血清的培养基中加入100ng/ml转化生长因子β, 100ng/mL白细胞介素-4, 100ng/mL白细胞介素-21、100ng/mL的γ-干扰素中和抗体,或相同试剂，不同浓度；所述步骤（3）中培养基为 RPMI-1640辅以10%胎牛血清+抗生素和100 u/ml 白细胞介素-2。

4.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（2）中采用免疫磁珠激活T细胞，免疫磁珠和细胞比例为1:1，或相似比例。

5.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述步骤（3）前还有对CD4+T细胞进行修饰步骤；优化方案中所述修饰步骤可以在CD4+T细胞被激活后4-96小时完成；更进一步优化方案中所述修饰步骤在CD4+T细胞被激活后24小时内完成。

6.根据权利要求5所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述修饰步骤为对CD4+T细胞转染或转导一段由DNA或RNA为载体的编码基因；优化方案中所述转染或转导的编码基因，包括但不限于嵌合式抗原受体，T细胞受体序列或其他细胞素或细胞表面受体；所述转染或转导的方法包括但不限于使用逆转录病毒，慢病毒或转座子。

7.根据权利要求6所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的方法，其特征在于：所述转染或转导的方法依次包括按照序列生产DNA质粒步骤、采用这些质粒进行逆转录病毒的包裹步骤、取得宿主T细胞并进行激活和极化步骤、在极化4-96小时后采用病毒对T细胞进行转导步骤，以及用上述方法继续扩增T细胞，直到达到所需的T细胞数目，或T细胞停止扩增。

8.根据权利要求1所述的一种极化和扩增CD4+T细胞的检测方法，其特征在于：所述细胞为体外检测和体内检测；

所述体内实验包括：

（a)采用鼠源肿瘤模型的小鼠作为受体，采用TCR转基因小鼠的T细胞作为供体，检测新亚群Thscm在携带肿瘤的小鼠体内的存活，性状和分化；

（b)采用几种鼠源癌症-TCR转基因供体细胞模型，研究新亚群供体细胞对多种，表达特异性抗原的固体和血液肿瘤癌细胞的杀伤作用，并观察小鼠的存活时间；

所述体外实验包括： 采用实时荧光定量PCR测量新亚群的基因表达，并与其他已经有的CD4+亚群所进行比较；具体为从C57B6的脾细胞中提取CD4+，CD62L+的细胞，诱导分化成为Th1, Th17和所述新亚群Thscm，再采用Qiagen的RNeasy Kit提取细胞的RNA，用ThermoFisher Scientific的SuperScript III将RNA逆转录为cDNA模板，并用附录中提供的引物做实时荧光定量PCR实验。

9.一种药物组合，其特征在于：组合包含了采用权利要求1-8中方法制备的细胞。

10.根据权利要求9所述的一种药物组合的应用，其特征在于：所述药物组合在治愈表达特异性抗原的肿瘤中的应用；所述肿瘤为固体肿瘤或血液肿瘤。