[发明专利]AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；

(2)所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞；

(3)筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；

(4)将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；

(5)将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；

(6)嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；

(7)阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；

(8)雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型；

采用Infusion方法构建所述重组打靶载体，具体操作如下：

使用细菌人工染色体BAC打靶，将2个loxP位点分别插入到内含子2和内含子3，当Cre表达时敲除小鼠AURKA基因第3号外显子，并用Neo基因替换、造成移码突变，使蛋白翻译提前终止在第3号外显子；

上游臂4.2kb，下游臂4.0kb，下游臂侧翼接磷酸甘油酸激酶启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因基因表达框，最终得到AURKA-CKO同源重组打靶载体；

所述重组打靶载体包含4.2kb5’同源臂、0.6kb两侧引入重组酶Loxp位点区域、磷酸甘油酸激酶新霉素抗性正筛选标记基因、4.0kb3’同源臂和单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选标记基因。

2.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述重组打靶载体进行线性化的具体操作为：

100μgAURKA-CKO同源重组打靶载体用酶用量300IU的NotI线性化，酶切体系为250μL，37℃消化过夜；之后用等体积的苯酚-三氯甲烷和三氯甲烷处理，无水乙醇沉淀，100μL无菌PBS重悬。

3.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述转染为电转染。

4.根据权利要求3所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述电转染的具体操作为：

ES细胞用胰酶消化后重悬于PBS中，取35μg载体DNA与0.8ml细胞混匀后加入电穿孔槽中，将电击后的细胞分入已铺好滋养层细胞的培养皿中，置于CO₂孵箱培养。

5.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆的具体操作为：

ES细胞在电穿孔24h和48h后分别换含有250mg/L选择药物G418和2μMGancyclovir培养液进行选择性培养，第7-8天挑取ES细胞克隆的基因组DNA，进行跨5’臂或3’臂和插入片段的长链PCR鉴定。

6.根据权利要求5所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，PCR鉴定时，5’臂的引物序列分别为P1：5’-GCAGGTCCTACTGGCAGATG-3’，P2：5’-CGTGCCTCTCCTTTCTGGAG-3’，目的片段为4.6kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环。

7.根据权利要求5所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，PCR鉴定时，3’臂的引物序列分别为P3：5’-AAGCTTGATATCGAATTCCGAA-3’，P4：5’-GCACTCGCAAGAAAAGGGTG-3’，目的片段为6.1kb，PCR反应条件为：95℃3min，98℃15s，61℃15s，68℃3min，68℃5min，共32个循环。

8.根据权利要求1所述的AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述供体小鼠为C57BL/6供体小鼠。