[发明专利]AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法

说明书

本发明涉及一种AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，通过先构建重组打靶载体，线性化后转染胚胎干细胞，筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，扩增后注入供体小鼠囊胚生产出嵌合体小鼠；嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代小鼠；阳性F1代小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，后代中获得具有AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除的小鼠模型。本发明所述的AURKA‑CKO1‑N条件性基因敲除小鼠模型，AURKA基因在特定组织和细胞类型中功能性缺失，为研究Aurora‑A在特定肿瘤发生发展中的作用机制提供理想模型。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。

背景技术

基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门新技术。基因敲除的定义是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。

Aurora-A是参与调控细胞有丝分裂的一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其编码基因定位于易位、缺失、扩增活跃的20q13.2染色体区域。意味着其表达模式具有天然的不稳定性。Aurora-A异常表达会引起细胞有丝分裂异常，进而导致基因组不稳定而诱发肿瘤形成。越来越多的研究显示，Aurora-A在结直肠癌、神经胶质瘤、乳腺癌、胰腺癌中异常高表达；此外，该区域扩增也被认为与患者预后不良有关。然而，Aurora-A参与肿瘤发生、发展的机制有待进一步阐明。然而，由于Aurora-A全身敲除小鼠容易造成小鼠胚胎致死。因此，构建条件性基因敲除小鼠模型为研究Aurora-A在肿瘤形成中的作用至关重要。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法。本发明的构建方法，通过利用Aurka基因flox小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，其后代flox纯合、Cre阳性小鼠的flox区域被敲除，导致Aurka基因在特定组织和细胞类型中功能性缺失，为有目的的研究Aurora-A在特定肿瘤发生发展中的作用机制提供理想的模型。

本发明所采用的技术方案为：

一种AURKA-CKO1-N条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建AURKA条件性基因敲除的重组打靶载体；

(2)所述重组打靶载体经线性化后，转染胚胎干细胞；

(3)筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；

(4)将筛选出的发生同源重组的阳性胚胎干细胞克隆经扩增后，注入供体小鼠的囊胚；

(5)将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；

(6)嵌合体小鼠与flp小鼠交配获得阳性F1代去Neo杂合子小鼠；

(7)阳性F1代去Neo杂合子小鼠与组织特异性表达Cre重组酶的小鼠交配后，获得双杂合的小鼠；

(8)雌性与雄性双杂合小鼠互交，后代中获得具有AURKA-CKO1-N条件性基因敲除的小鼠模型。

采用Infusion方法构建所述重组打靶载体，具体操作如下：

使用细菌人工染色体BAC打靶，使2个loxP位点分别插入到内含子2和内含子3，当Cre表达时可敲除小鼠AURKA基因第3号外显子，并用Neo基因替换、造成移码突变，使蛋白翻译提前终止在第3号外显子；

上游臂4.2kb(DNA千碱基对)，下游臂4.0kb，下游臂侧翼接磷酸甘油酸激酶启动子介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶负筛选基因基因表达框，最终得到AURKA-CKO同源重组打靶载体。