[发明专利]一种胚胎生产冷冻工艺

权利要求书

1.一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选择供体母羊和供体公羊：选择具备有优良的遗传特性和较高的育种价值，无病，健康状况良好，膘情适中，生殖系统机能正常的供体母羊和供体公羊，并且供体母羊选择2-5胎的母羊，供体公羊选择1.5-6岁的公羊；

(2)供体公羊精液采集：对选择出的供体公羊精液进行采集，并鉴定精液的质量，合格的精液按照合适的稀释比例进行稀释，以备输精使用；

(3)供体母羊超数排卵：体内刺激供体母羊使其超数排卵；

(4)输精：输精前供体母羊需空腹禁食12h，采用腹腔镜寻找到供体母羊的子宫角，采用装有精液的输精枪在两组子宫角内注入适量的精液；

(5)胚胎采集：在受精后2-3天时或5-6天时，利用冲卵液进行冲胚，从超排供体母羊体内将胚胎冲出，并收集在器皿中；

(6)胚胎鉴定：胚胎收集后，立即镜检鉴定胚胎质量，并对胚胎进行胚胎等级鉴定，根据胚胎质量与品种档案进行分组保存；

(7)配制冷冻所需溶液：配制冷冻胚胎所需要的预处理液和冷冻溶液；

(8)冷冻前胚胎前处理：将质量良好的胚胎依次放入预处理液和冷冻液中分别平衡5min；

(9)胚胎装管：在10min内将胚胎全部装入细管中，每只细管装入3-5枚胚胎，用细管塞封口，并将胚胎记录标记在细管塞上；

(10)冷冻：将装入胚胎后的细管放入冷冻仪中，采用慢速降温或快速降温的方法使胚胎冷却至-35℃；

(11)保存：在胚胎冷却至-35℃时将细管由冷冻仪中取出并投入液氮中冷冻保存，每周补充液氮，每年更换液氮。

2.如权利要求1所述的一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，所述步骤(5)中的冲胚包括输卵管冲胚或子宫角冲胚。

3.如权利要求1所述的一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，所述步骤(6)中的胚胎等级包括A级胚胎、B级胚胎、退化胚胎和无受精卵。

4.如权利要求1所述的一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，所述步骤(7)中的预处理液包括以PBS为基础溶液配制的体积分数为5％的Ethylene glycol溶液、以PBS为基础溶液配制的体积分数为5％的Glycerol溶液、以PBS为基础溶液配制的体积分数为5％二甲基亚砜溶液和以PBS为基础溶液配制的体积分数为2.5％的Ethylene glycol与2.5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的BSA，使用时配合含有相通抗冻保护剂的冷冻液使用。

5.如权利要求1所述的一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，所述步骤(7)中的冷冻液包括以PBS为基础溶液配制的体积分数为10％的Ethylene glycol溶液、以PBS为基础溶液配制的体积分数为10％的Glycerol溶液、以PBS为基础溶液配制的体积分数为10％二甲基亚砜溶液和以PBS为基础溶液配制的体积分数为5％的Ethylene glycol与5％的二甲基亚砜混合溶液，并添加0.3％的BSA。

6.如权利要求1所述的一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，所述步骤(9)中的胚胎装管包括以下步骤：

a、先在细管中吸取0.5cm长的保存液；

b、其次吸取0.3cm的空气；

c、然后吸取含胚胎的冷冻液0.5cm；

d、再吸取0.2cm的空气；

e、最后吸取0.3cm的保存液。

7.如权利要求1所述的一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，所述步骤(10)中的慢速降温适用于2-3d的胚胎，包括以下步骤：

a、设置降温速度为1℃/min，将胚胎由20℃降至-7℃；

b、-7℃时植入制冷剂晶母，停留20min，诱发结晶，并在此期间检查结晶情况；

c、设置降温速度为0.3℃/min，将胚胎由-7℃降至-35℃。

8.如权利要求1所述的一种胚胎生产冷冻工艺，其特征在于，所述步骤(10)中的快速降温适用于5-6d的囊胚，包括以下步骤：

a、设置降温速度为3℃/min，将胚胎由20℃降至-6℃；

b、-6℃植冰，停留8min，在此期间检查植冰情况；

c、设置降温速度为0.5℃/min，将胚胎由-6℃降至-35℃。