[发明专利]一种离体胎盘造血干细胞的制备方法

说明书

本发明提供一种离体胎盘造血干细胞的制备方法，一种离体胎盘造血干细胞的制备方法，其特征在于：包括：胎盘预处理；对预处理之后的胎盘进行灌注清洗；使用酶解液进一步的收集液体；制作胎盘造血干细胞，与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：整个操作过程简单有效，实验操作时间短，显著提高分离提取效率，获得的细胞数量大，造血干细胞的含量大大提高，细胞数量较稳定；同时优化提取分离的条件，尽可能的提高造血干细胞的存活率，细胞污染率极低。

技术领域

本发明是一种离体胎盘造血干细胞的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

最新研究表明，胎盘中含有大量造血干细胞，同脐带血中的造血干细胞一样，胎盘造血干细胞是高度未分化细胞，也可以说它是一切血细胞（其中大多数是免疫细胞）的原始细胞，可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病，包括血液系统恶性肿瘤（如白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增生综合症、淋巴瘤等）、血红蛋白病、骨髓造血功能衰竭（如再生障碍性贫血）、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患等多种疾病。

胎盘中造血干细胞的含量是脐带血中造血干细胞含量的10倍，足可供小孩自用几次或1～2个成人患者使用1一次，有效解决了移植时骨髓或动员后外周血来源不足，脐带血数量不够等技术难题，将有望取代骨髓、动员后外周血和脐带血用于造血干细胞移植。

目前，从胎盘中提取造血干细胞的流程为：（1）先将整个胎盘或胎盘绒毛膜组织用机械法分解成小块；（2）然后采用一种或几种酶进行消化，消化后过滤；（3）最后采用羟乙基淀粉(HES)法或淋巴分离液法回收含有造血干细胞的单个核细胞，有些还会在离心分离后采取免疫磁珠、流式细胞等方法，富集造血干细胞。现有技术存在以下缺陷：（1）分离得到的胎盘造血干细胞含量较低，如专利“从胎盘组织中提取造血干细胞用于建立造血干细胞库的新方法”中提取的单核细胞数为2～4×109，其中CD34阳性的造血干细胞含量仅为0.3～0.7%，则CD34阳性的造血干细胞数最多为2.8×107；（2）整个胎盘或胎盘绒毛膜组织体积都比较大，因此处理量大，不仅要用很大量的消化酶，增加了成本，而且还耗费时间，不利于细胞活性的保持。

另外，目前胎盘造血干细胞冻存液中大都添加血清或白蛋白等生物源性成份来保证冻存复苏后干细胞的生长需要/保持干细胞的高存活率。但目前还没有适合临床应用的血清，血清含有大量未知成分，质量不易控制，用于异体输注存在安全隐患，比如血清含有不能治愈的病毒或病原体，接受干细胞治疗的病人便会因而染病，后果十分严重。而合适浓度的白蛋白虽然在一定时间内也能保持细胞的高存活率，但目前所使用的白蛋白都是人源性或动物源性，存在安全隐患，不适合临床应用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种离体胎盘造血干细胞的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种离体胎盘造血干细胞的制备方法，包括：

胎盘预处理；

对预处理之后的胎盘进行灌注清洗；

使用酶解液进一步的收集液体；

制作胎盘造血干细胞。

进一步地，所述胎盘预处理的具体步骤为：在无菌手术室环境下采集正常顺产或剖腹产者的健康胎盘，分离出脐动脉和脐静脉，用清洗液清洗胎盘，收集清洗液。

进一步地，所述健康胎盘需经过造血干/祖细胞定性检测，判断是否健康，若健康则分离出脐动脉和脐静脉，用清洗液清洗胎盘，收集清洗液，若不健康则放弃处理，所述清洗液为抗生素含量100～1000mg/L的溶液。

进一步地，对预处理之后的胎盘进行灌注清洗的具体步骤为：用灌注装置的第一灌注针和第二灌注针分别插入至分离出脐动脉和脐静脉，然后通过灌注装置的第一灌注针和第二灌注针导入灌洗液，对胎盘进行灌注清洗，收集灌洗后的混合液一。