[发明专利]一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法

说明书

本发明涉及一种适用于植物的Hi‑C高通量测序建库方法，包括：(1)样品冰上真空甲醛交联；(2)裂解交联后物料，释放染色质；染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI内切酶酶切打断获得酶切后物料；MboI内切酶的浓度为5000units/mL，酶切条件为：900rpm，37℃孵育过夜；(3)酶切后物料进行末端修复；(4)末端修复后DNA分子内连接；(5)解交联分子内连接后物料并去除未连接的末端生物素，获得纯化DNA，超声波随机打断DNA成利于测序的片段大小从而获得DNA测序文库。该方法通过设计合适的甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶，解决了植物细胞难释放细胞质、质量不好的植物样品建库效果差的技术问题，实现了植物的Hi‑C高通量测序建库，扩大了Hi‑C技术的适用范围。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法。

背景技术

染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息，此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获，并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。近年来，在第二代测序技术的迅速发展下，由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象，研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。在Hi-C技术中，以整个细胞系为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛，贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的，在连接前，使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端连接后，提取DNA并使用超声波对DNA进行随机打断，最后捕获生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的互作。将通过第二代测序得到的DNA序列对比对到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间连接频率的矩阵。

常规的Hi-C高通量测序建库以细胞系作为研究对象，其染色质比较单一，更容易获得比较好的结果，但是限制了其使用范围，距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远。如植物不同于细胞系，其复杂的细胞壁结构不能用单纯裂解细胞的方式释放细胞核。同时，试验发现，采用现有技术处理质量不好(如病虫害植物样品)的植物样本时，细胞核无法释放完全，同时内源酶灭活效果不好也影响后续酶切反应效果，从而影响文库数据的有效性。因此有必要开发一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法，该方法通过设计合适的甲醛交联条件、内源酶灭活条件以及合适的工具酶，解决了植物细胞难释放细胞质、质量不好的植物样品建库效果差的技术问题，实现了植物的Hi-C高通量测序建库，扩大了Hi-C技术的适用范围。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种适用于植物的Hi-C高通量测序建库方法，所述方法包括以下步骤：

(1)对植物样品进行甲醛交联获得交联后的物料，所述甲醛交联步骤包括：将植物样品与预冷的交联体系混合后置于冰上真空孵育30-40min进行甲醛交联，孵育结束后加入甘氨酸终止交联；

(2)液氮研磨和裂解液并行裂解交联后物料，使裂解细胞释放细胞染色质并收集细胞染色质；细胞染色质依次经SDS灭活内源酶、经MboI核酸内切酶酶切打断获得酶切后物料；所述MboI核酸内切酶的浓度为5000units/mL，所述酶切反应条件为：900rpm，37℃孵育过夜；

(3)用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行粘性末端补平，获得末端补平后DNA；