[发明专利]一种用于检测猪圆环病毒2型和3型的试剂盒、引物对、探针及方法

权利要求书

1.一种用于检测PCV-2和PCV-3的试剂盒，其包括PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括两引物对和两探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中的引物的浓度分别为200～400nM，较佳地为200nM；所述探针的浓度为200～400nM，较佳地为400nM。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系还包括PCR反应液和Taq酶，所述PCR反应液包括Mg²⁺、dNTP以及PCR反应缓冲液，所述Taq酶为热启动Taq酶；较佳地：

所述Mg²⁺的浓度为1～2.5mmol/L，更佳地为2.0mmol/L；

和/或，所述dNTP的浓度为0.1～0.25mmol/L，更佳地为0.2mmol/L；

和/或，所述PCR缓冲液为2×PCR缓冲液；

和/或，所述热启动Taq酶的用量为0.1～0.5U/反应。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针混合液由所述两引物对和所述两探针组成，所述两引物对中各引物的量为0.5μL、浓度为10μM，所述两探针中，各探针的量为0.5μL、浓度为10μM；所述PCR反应液由10μL 2×PCR缓冲液、2μL 25mM的MgCl₂、1μL10mM的dNTP以及2μL DEPC-H₂O组成，所述Taq酶为1μL 5U/μL的Taq酶。

5.如权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为实时荧光定量PCR试剂盒；和/或，

所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含有PCV-2和PCV-3目的基因序列的重组质粒，较佳地，所述阳性对照的浓度为3.1×10⁶拷贝/μL；所述阴性对照为去离子水，较佳地为DEPC-H₂O。

6.检测PCV-2和PCV-3的引物对，其特征在于，所述引物对的一对是序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸，另一对是序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸；较佳地，所述的检测通过实时荧光定量PCR进行。

7.检测PCV-2和PCV-3的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；较佳地，所述的检测通过实时荧光定量PCR进行。

8.检测PCV-2和PCV-3的组合，所述的组合包括引物对和探针，其特征在于，所述的引物对的一对是序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸，另一对是序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核酸；所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；较佳地，所述的检测通过实时荧光定量PCR进行。

9.如权利要求6所述的引物对和/或如权利要求7所述的探针，或者权利要求8所述的组合在制备检测PCV-2和PCV-3的试剂盒中的应用；较佳地，所述试剂盒为双通道实时荧光定量PCR试剂盒。

10.一种非诊断目的的检测PCV-2和PCV-3的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)使用DNA提取试剂提取待检样品中的总DNA；

(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，利用权利要求1～5任一项所述试剂盒中的PCR反应体系进行PCR反应；

(3)分析检测结果；

较佳地：

步骤(1)中所述DNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H₂O中的一种或多种；较佳地，所述样品裂解液为Trizol，所述DEPC-乙醇为质量百分数为75％的DEPC-乙醇；

和/或，步骤(2)中所述PCR反应的反应条件为：

(1)94～95℃10～15min；(2)94～95℃10～15s；(3)55～60℃35～60s；(2)-(3)循环40～45次。