[发明专利]一种用于检测猪圆环病毒2型和3型的试剂盒、引物对、探针及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测PCV‑2和PCV‑3的试剂盒、引物对、探针及方法。本发明试剂盒包括RT‑PCR反应体系，其包括引物探针混合液，所述引物探针混合液包括两引物对和两探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。该方法在闭管状态下进行扩增反应及产物检测，避免了扩增产物污染而致的假阳性；探针杂交特异性更强、敏感性更高；PCR后无需后续处理，操作更简单快速，安全无污染；可同时实现PCV‑2和PCV‑3两种病毒的检测。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种用于检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)的试剂盒、引物对、探针及方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)广泛存在于自然界中，对猪有很强的感染力，各种品种、年龄、不同性别的猪只均可感染。PCV-2主要侵害猪的免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致被感染的猪产生免疫抑制和其它病原微生物的继发感染。该病毒与猪群中发生的许多疾病关系密切，这些相关疾病统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。PCV-2在世界范围内广泛分布并且在猪群中存在至少有50多年，血清学和病原学调查己证实全世界范围内许多国家和地区的猪群均存在PCV-2感染，几乎100％的商品化养猪场感染过PCV-2，严重影响世界养猪业的发展。自2000年猪圆环病毒病首次在我国报道以来，除西藏、新疆、澳门未见报道外，其余各省、市、自治区均有PCV-2病毒分离和发生感染的报道。王佳慧利用PCR方法对中国16个省市75个规模化猪场2010-2011年间的688份样品进行检测，被检猪场PCV-2阳性率为58.67％。

2016年美国学者Phan等报道了一种新的猪圆环病毒亚型-猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV-3)，携带该病原的猪呈现生长发育不良、心脏和多系统炎性浸润等病理变化，随后Palinski等也从表现皮炎肾病综合症的猪体内检测到了PCV-3，这些研究结果意味着新出现的PCV-3作为一种新的致病病原必须引起人们的重视。随后，中国、韩国、波兰、巴西等国家陆续报道了该病，表明该病已经在世界各地广为传播。2017年我国学者Deng等采用间接ELISA对我国猪群开展了PCV3的血清学调查，结果发现，2015-2017年间，我国猪群PCV3的感染率从22.35％上升到51.88％，表明PCV3已经在我国猪群流行和扩散，防控形势非常严峻。

据报道，PCV-3可导致母猪厌食、皮炎肾病综合征、繁殖障碍，如流产、产木乃伊胎、死胎、弱仔等症状，其症状与PCV-2相似；由于PCV-3可从患有PDNS症状母猪及其流产胎儿体内检出，间接证明PCV-3具有垂直传播的特性；同时有研究表明该病毒可通过公猪精液传播。Fan等报道从湖北和广东发生繁殖障碍的母猪和急性死亡仔猪体内发现了该病毒。Shen等和Ku等报道表明我国已有13个省的猪群中都感染了PCV-3，主要分布在中东部地区。Ku等报道的通过普通PCR从辽宁、重庆3个猪场中的22份样品中发现，PCV-3和PCV-2单独感染率各为62.29％和34.7％，混合感染率为15.8％。鉴于PCV-3和PCV-2所引起的疾病症状非常相似，在临床上很难区分，且PCV-3呈现多地域感染的现状，建立快速、准确的鉴别PCV-3和PCV-2的方法是有效诊断和防控我国猪群感染PCV-3和PCV-2的基础。