[发明专利]一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法

说明书

本发明公开了一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法，将山茶属植物茶树、油茶或红山茶的组培苗切除3/4叶片，以带1/4叶片的茎段作为外植体，接种到体细胞胚诱导培养基上，在24～26℃、光照下培养，茎节及叶柄处形成体细胞胚；选取体细胞胚切成1～5mm厚的切片，将切片平铺至体细胞胚增殖培养基上，在24～26℃、光照下培养，可形成新的体细胞胚；将体细胞胚转移至植株再生培养基上，在24～26℃、光照下培养，可由体细胞胚再生出小植株。本发明以山茶属植物幼嫩茎段为外植体，建立了高效的体细胞胚发生和植株再生体系，可有效提高山茶属植物组培繁殖效率，从而为茶树、油茶和茶花等作物的种苗生产与基因工程改良等提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及植物诱导再生技术领域，具体涉及一种山茶属植物高效体细胞胚发生和植株再生的方法。

背景技术

自古至今，山茶属植物在我国被广泛用作饮料(茶)、食用油(山茶油)和观赏花卉(茶花)。山茶属植物组织培养研究始于上世纪70年代，主要以茎尖、腋芽、茎段、叶片、子叶、下胚轴、胚和花药等组织为外植体，通过器官发生的方式，建立了植物再生技术。由于这些再生技术体系的植株再生效率或增殖效率较低，目前还难以在生产或基因工程上广泛应用。

上世纪80年代以来，通过体细胞胚发生方式的植株再生研究在山茶属植物上取得了一些进展。据报道，体细胞胚发生方式获得的再生植株具有发达的根系和较强生长势。多数报道采用山茶属植物幼嫩或成熟种子(子叶和胚轴等)作为外植体进行愈伤组织或体细胞胚诱导并再生植株(颜慕勤和陈平，油茶体细胞胚状体的发生，1980；庄承纪等，茶梅体细胞胚胎发生和植株的再生，1988；刘德华和廖利民，茶树组织培养的研究——Ⅰ.胚状体和胚性细胞团的形成及植株再生，1989；王玉书等，茶树未成熟胚组培育苗技术的研究，1990；Wachira和Ogada，In vitro regeneration of Camellia sinensis(L.)O.Kuntze bysomatic embryogenesis，1995；杜克久等，云南大叶茶体细胞胚发生及体细胞胚苗形成体系的建立，1997；张智俊等，油茶优良无性系子叶体细胞胚植株再生，2005；Roy，Somaticembryogenesis and plant regeneration from immature and mature cotyledonarytissues of cultivated darjeeling tea[Camellia sinensis(L).O.Kuntze]，2006；Lü等，Plant regeneration via somatic embryogenesis and shoot organogenesis fromimmature cotyledons of Camellia nitidissima Chi 2013；胡玉玲等，普通油茶体胚再生体系研究，2014)。由于山茶属植物是高度杂合的，根据孟德尔遗传规律，由种子繁育的后代将出现严重的性状分离。因此，上述以生殖器官-种子的某个部位作为外植体获得的无性繁殖后代将产生严重的农艺性状的分离，难以保持母本品种的全部优良特性。如果采用与母本品种遗传背景一致的营养器官作为外植体，离体培养获得的再生植株将不会发生性状分离，能够保持母本品种的优良特性。因此，以山茶属植物叶柄、茎节及根等营养器官组织作为外植体，诱导体细胞胚发生并再生植株的研究受到人们的关注并取得了重要进展(Vieitez等，Somatic Embryogenesis from Roots of Camellia japonica PlantletsCultured in Vitro，1991；王毅军等，茶(Camellia sinensis Kuntze)体培养体细胞胚胎发生的组织细胞学研究，1994；Akula和Dodd，Direct somatic embryogenesis in aselected tea clone,‘TRI-2025’(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)from nodalexplants，1998；刘德华等，茶树不同组织体细胞胚、不定芽分化的研究，1999；蔡冬元，油茶叶片脱分化后的再分化技术研究，2014)。但是，前人的研究报道中，由外植体诱导获得体细胞胚的时间比较长，培养基成分比较复杂，或体细胞胚增殖效率较低，或植株再生效率较低，并因此限制了植株再生和扩繁的速度，从而导致上述植株再生体系仍然难以在茶树、油茶或茶花的种苗生产或基因工程领域广泛应用。