[发明专利]NADH依赖性的氨基酸脱氢酶及其在提高赖氨酸产量中的应用

说明书

本发明提供了NADH依赖性的氨基酸脱氢酶在提高赖氨酸产量中的应用，所述氨基酸脱氢酶分别为来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶，来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶，来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶，来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、3、5、7所示。本发明的氨基酸脱氢酶能利用NADH或同时利用NADH和NADPH作为辅因子合成赖氨酸从而减少细胞对NADPH的需求，进而显著的提高赖氨酸或者戊二胺的产量。

技术领域

本发明属于基因工程和生物发酵技术领域，具体地说，涉及一种NADH依赖性的氨基酸脱氢酶及其应用。

背景技术

赖氨酸是一种极其重要的氨基酸，广泛应用于饲料添加剂、保健及医药领域。目前，赖氨酸的工业生产主要通过微生物发酵法进行，工业常用的菌种包括谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌。在赖氨酸的生物合成过程中，有四步酶促反应过程需要消耗NADPH用于合成赖氨酸。因此，传统的方法都是通过强化NADPH的供应，例如提高戊糖磷酸循环途径的代谢通量，或者表达NADPH依赖型的甘油醛3-磷酸脱氢酶，用于平衡赖氨酸合成过程中的辅酶需求，从而提高赖氨酸的产量。在戊二胺的生产过程中同样存在高度依赖NADPH的问题，戊二胺是通过在赖氨酸生产菌株中表达赖氨酸脱羧酶脱而获得。在微生物细胞内，NADH的浓度一般远大于NADPH，且NADH的稳定性比NADPH更高，价格更加便宜，因此直接利用胞内的NADH合成赖氨酸或戊二胺具有极大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种NADH依赖性的氨基酸脱氢酶及其应用。

赖氨酸和戊二胺合成途径中有四步反应消耗NADPH：(1)草酰乙酸的氨基化生成天冬氨酸；(2)磷酸天冬氨酸还原生成天冬氨酸半醛；(3)二氢吡啶二羧酸还原生成哌啶二羧酸；(4)哌啶二羧酸还原生成二氨基庚二酸。目前大部分微生物体内发现的催化上述步骤的酶都是严格依赖于NADPH。本发明通过大量的生物信息学分析和反复对比实验，在大肠杆菌中表达不同来源的氨基酸脱氢酶的基因，检测其催化活性，及对辅酶NADH、NADPH的特异性进行检测发现，来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)，来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示)，来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)可以利用NADH催化上述四步反应。

因此，本发明提供了NADH依赖性的氨基酸脱氢酶，所述氨基酸脱氢酶为：

来源于Pseudomonas aeruginos的天冬氨酸脱氢酶；

来源于Tistrella mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶；

来源于Mycobacterium tuberculosis的二氢吡啶二羧酸还原酶；和/或来源于Tepidanaerobacter acetatoxydans的二氨基庚二酸脱氢酶；

其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、3、5、7所示或如SEQ ID No.1、3、5、7所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸而不影响其生物活性的氨基酸序列。

经过密码子优化，本发明提供了编码上述述NADH依赖性的氨基酸脱氢酶的基因，其核苷酸序列分别含有如SEQ ID NO.2、4、6、8所示的核苷酸序列或SEQ ID No.2、4、6、8所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个碱基的具有90％以上同源性的、编码相同功能氨基酸脱氢酶的核苷酸序列。