[发明专利]一种高通量研究水稻转录因子的方法

说明书

本发明公开了一种高通量研究水稻转录因子的方法，涉及分子生物学与生物化学领域，方法包括将水稻中的1800个转录因子基因序列通过在合适的位点设计引物并用PCR将目标序列扩增出来，扩增产物通过同源重组方法连接进入酵母双杂交的AD载体PGADT7，构建成功的AD载体通过大肠杆菌进行扩繁、抽提并测序鉴定，鉴定正确的载体转入酵母Y187菌株，生成最终的水稻转录因子文库。本发明为对水稻转录因子进行高通量一对一的筛选的方式提供可行性，所得的阳性质粒无需再进行后续一对一验证及测序，简化了工作流程，提高了水稻转录因子的研究效率。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物化学领域，尤其涉及一种利用酵母文库高通量研究水稻转录因子的方法。

背景技术

酵母文库是研究植物蛋白与基因的理想模型。目前主流的应用是在酵母双杂交中，其主要目的是研究蛋白质的相互作用。也有利用酵母文库进行的单杂实验，用于研究蛋白与DNA的相互作用，由于这一特点单杂实验也可以用于研究转录因子与基因的相互作用关系。

转录因子是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

但是酵母文库一般都包含一个物种内所有的转录信息，因此对于研究转录因子并不是十分合适。这就需要单独构建一套转录因子文库，这是一件十分繁琐的工程，目前已有一些物种有构建好的转录因子文库，比如拟南芥。但是水稻还一直没有这样形式的文库。

传统的筛库实验在筛选得到阳性克隆后，需要进行后续的一对一重复验证试验来确认是否真的为阳性克隆，这就造成后续实验十分繁琐。因此，本领域的技术人员致力于开发一种高通量研究水稻转录因子的方法，以期解决上述问题。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明克隆得到了1800个水稻转录因子的酵母文库，该文库可以用作研究蛋白与蛋白的相互作用，更重要的是它还能用于研究蛋白与DNA的相互作用。并对这一文库的应用提出了一种实验方法。

本发明解决研究水稻转录因子难题所采用的技术方案是：购买或通过从DNA克隆方式得到1800个水稻转录因子。通过PCR扩增每一个转录因子从合适位置开始的PCR产物，并在两端加上通用的重组臂，再利用重组酶将这1800个水稻转录因子一一连到载体上。再将载体分别转入酵母菌中，制备成水稻转录因子文库。每一个转录因子都被保存在各自的酵母菌中，酵母菌用96孔深孔保存。每一个孔保存一个转录因子。

由于每一个孔内的转录因子都是已知序列，因此在后续筛库中，只需要做一对一验证，在筛选培养基上观察克隆，如出现阳性克隆则就能证明互作，且能直接找到对应的转录因子，无需后续的验证试验

本发明一方面在于提供了一种构建水稻转录因子库的方法，另一方面提供了一种新的研究水稻转录因子的方法。

本发明提供研究水稻转录因子的方法，包括构建水稻转录因子库以及一对一转录因子mating两部分。

构建水稻转录因子库是将购买所得的1800个转录因子利用PCR的方式将其从原来的载体上克隆下来，并将其连接到最终载体PGADT7上，然后将载体一一转入酵母菌中。

构建水稻转录因子库

(1)设计引物将1800个转录因子从原先载体上扩增下来，并在两端引入重组位点或合适的酶切位点；2)通过重组酶或限制性内切酶及DNA连接酶将扩增出来的转录因子一一连接到表达载体PGADT7上，然后转入大肠杆菌感受态细胞进行扩大培养，获得连有转录因子的质粒；3)将获得的质粒再转入酵母Y187的感受态细胞中；4)鉴定验证阳性克隆，将正确的克隆转入96孔深孔板扩大培养，每一个孔是一个转录因子。

一对一mating