[发明专利]一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：

(1)反转录和荧光定量RT-PCR扩增混合液：

该混合液包含反转录和荧光定量扩增引物以及探针，其序列如SEQ ID NO：1～6所示；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

(2)阴性对照；

(3)阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的阳性对照质粒。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述序列SEQ ID NO：1-2是猪流行性腹泻病毒扩增引物；所述序列SEQ ID NO：4-5是猪传染性胃肠炎病毒扩增引物；所述序列SEQID NO：5是猪流行性腹泻病毒带荧光标记的探针；所述序列SEQ ID NO：6是猪传染性胃肠炎病毒带荧光标记的探针。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，阳性对照来自病毒核酸RNA经反转录后，其特异基因片段与质粒连接所得的重组质粒混合物；其中特异基因分别为猪流行性腹泻病毒的N基因、猪传染性胃肠炎病毒的N基因；其中，猪流行性腹泻病毒的N基因序列如SEQ IDNO：7所示，猪传染性胃肠炎病毒的n基因序列如SEQ ID NO：8所示。

4.利用权利要求1所述试剂盒实现检测PEDV-TGEV的双重荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)磁珠法提取样品DNA/RNA；

用磁珠DNA/RNA共提取试剂盒和全自动核酸提取仪同时提取样品中的RNA，得到200μL样品；

(2)双重荧光定量RT-PCR扩增

a)取预混冻干液，其中已按如下要求配制22μL反应体系：2.5μL RT-PCR 5×buffer，2.5μL dNTPs mix，0.5μL Reverse enzymes mix，2.5μL 5×Q-solution；5.2μL引物混合液，其中包括PEDV/TGEV的上下游引物各1.15μL，PEDV的探针0.2μL、TGEV的探针0.4μL；rTaq酶1μL、2.5μL 10×PCR buffer，5.3μL H₂O补足，-20℃冻干，储存于2-8℃；

b)加入25μL灭菌H₂O回溶冻干颗粒，加入3μL待检样品RNA或者阴性对照或阳性对照；

c)每次检测时设置2管阳性和两管阴性对照，检测管放入荧光定量PCR仪中；

反应条件：42℃30min；95℃15s，60℃1min，40个循环，60℃为荧光信号采集温度，荧光信号分别在FAM和HEX通道进行采集；

(3)结果描述及判定

a)质控标准：

PEDV和TGEV阳性对照Ct值分别都＜32，且有典型扩增曲线；阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线；

如阴性对照和阳性条件不同时满足以上条件，此次试验视为无效；

b)结果判断：

扩增结果按下述方式进行判断：

阳性：在FAM通道Ct值小于38且有典型扩增曲线，表示样本中存在猪流行性腹泻病毒的核酸；在HEX通道Ct值小于38且有典型扩增曲线，表示样本中存在猪传染性胃肠炎病毒的核酸；

阴性：无特异性扩增条带或者无Ct值，表明样品中猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒。