[发明专利]一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

本发明涉及检验检疫领域，旨在提供一种用于检测PEDV‑TGEV核酸的双重荧光定量RT‑PCR检测试剂盒。(1)反转录和荧光定量RT‑PCR扩增混合液：该混合液包含反转录和荧光定量扩增引物以及探针，其序列如SEQ ID NO：1～6所示；其中，反转录引物为12碱基随机引物；(2)阴性对照；(3)阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的阳性对照质粒。与现有方法比较，本发明具有高通量、节省费用、特异性好、灵敏度高的优点。

技术领域

本发明提供了一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸的双重荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒，可实现同时检测2种引起猪病毒性腹泻症候群的病原，属于检验检疫领域。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)是目前危害我国养猪场中哺乳和断奶仔猪腹泻的最重要的病原，其发病率和死亡率都较高，且发病和传播迅速，比较难以控制，给养猪业带来重大损失。一旦感染该病，仔猪常表现出水样腹泻、常脱水直至死亡。猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒都属于冠状病毒科成员，临床上呈单独感染或者混合感染，由于PEDV和TGEV引起的临床症状、病理变化十分相似，在临床上的鉴别诊断较困难，因此应用实验室的检测方法快速准确区分由哪种病原感染，对于防控病毒性腹泻疾病具有重要的意义。由于该发病迅速，及时的诊断是防控该病有效手段，目前尚没有一种方法可以一次性对引起猪病毒性腹泻的2种病原体进行鉴别诊断。因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于猪病毒性腹泻的预防和控制至关重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于检测 PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒中包括：

(1)反转录和荧光定量RT-PCR扩增混合液：

该混合液包含反转录和荧光定量扩增引物以及探针，其序列如SEQ ID NO：1～6所示(见表1)；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

(2)阴性对照；

(3)阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 的阳性对照质粒。

本发明中，所述序列SEQ ID NO：1-2是猪流行性腹泻病毒扩增引物；所述序列SEQID NO：4-5是猪传染性胃肠炎病毒扩增引物；所述序列SEQ ID NO：5是猪流行性腹泻病毒带荧光标记的探针；所述序列SEQ ID NO：6是猪传染性胃肠炎病毒带荧光标记的探针。

本发明中，阳性对照来自病毒核酸RNA经反转录后，其特异基因片段与质粒连接所得的重组质粒混合物；其中特异基因分别为猪流行性腹泻病毒(PEDV)的n基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的n基因；其中，猪流行性腹泻病毒(PEDV)的n基因序列如SEQ ID NO：7所示，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的n基因序列如SEQ ID NO： 8所示。

本发明进一步提供了利用前述试剂盒实现检测PEDV-TGEV核酸的双重荧光定量RT-PCR检测的方法，包括以下步骤：

(1)磁珠法提取样品DNA/RNA；

用磁珠DNA/RNA共提取试剂盒和全自动核酸提取仪同时提取样品中的RNA，得到200μL样品；

(2)双重荧光定量RT-PCR扩增