[发明专利]一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于多支杂交链式反应的生物靶标分子检测传感器，所述生物靶标分子经预处理后得到包含a序列的目标DNA，其特征在于，所述生物靶标分子检测传感器包括发夹探针H1、H2、H3，

H1包括H1b、H1a’、H1c三个部分，H1a’为a序列的互补序列，H1b包括b1和b2，H1c包括c1和c2，b2与c2互补成双链作为H1发夹结构的茎部，H1a’和c1作为发夹结构的环部，b2的长度小于H1a’；

H2包括H2b’、H2d、H2c’三个部分，H2b’包括b2’和b1’，H2c’包括c2’和c1’，b2’与c2’互补成双链作为H2发夹结构的茎部，b1’和H2d作为发夹结构的环部，H2b’与H1b互补，H2c’与H1c互补，H2d为目标DNA互补链以外的一段碱基序列；

H3包括H3e、H3f、H3e’、H3g四个部分，其中H3e与H3e’互补成双链作为H3发夹结构的茎部，H3f形成发夹结构的环部，H3g为H3的3’端单链粘性末端，H3e’和H3g与H2d互补；

H1b、H1a’、H2d序列长度均为18-28bp；所述H2或H3上修饰有信号标记；

还包括金界面上自组装有DNA探针的电极或芯片，所述DNA探针具有与H3的H3f及H3e的部分序列互补配对的序列；

利用所述生物靶标分子检测传感器的核酸检测方法，包括以下步骤：

(1)将待测样本预处理得到含有目标DNA的溶液，所述目标DNA包含a序列；

(2)合成所述发夹探针；

(3)基于多支杂交链式反应进行核酸检测：往含有目标DNA的溶液中加入H1、H2、H3，混合，室温下反应，形成多支杂交链反应产物，再将金界面上自组装有DNA探针的载体置于反应溶液中，DNA探针与H3杂交将多支杂交链反应产物捕获到金界面上；然后分析金界面上的信号标记变化测定溶液中目标DNA的含量，进而计算出待测样本中目标物的含量。

2.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，所述的待测样本为DNA、RNA、药物/生物小分子、抗原/抗体、酶、外泌体或肿瘤细胞。

3.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，步骤(1)中，所述的含有目标DNA的溶液的缓冲体系为SPSC溶液。

4.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，H1b、H1a’、H2d序列长度均为24bp，其中b1、c1、b1’、c1’为6bp，b2、c2、b2’、c2’为18bp；H3由两个18个碱基的茎部H3e、H3e’，8个碱基的环部H3f和6个碱基的粘性末端H3g组成。

5.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，所述H2或H3的5’端标记有生物素或荧光基团。

6.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，H1、H2、H3的工作浓度为1nM-100μM。

7.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，还包括用于辅助目标DNA打开H1发夹结构的辅助链，所述H1的3’端具有单链粘性末端H1x，所述辅助链与H1x及H1c的部分序列互补。

8.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，所述的DNA探针为锁核酸探针或肽核酸探针。

9.如权利要求1所述的生物靶标分子检测传感器，其特征在于，当目标DNA为p53基因中的Exon-5时，H1的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，H2的序列如SEQID NO.4所示，H3的序列如SEQ ID NO.5所示；

当目标DNA为p53基因中的Exon-6时，H1的序列如SEQ ID NO.6所示，H2的序列如SEQ IDNO.4所示，H3的序列如SEQ ID NO.5所示。