[发明专利]一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及应用，属于生物检测技术领域。所述检测方法包括：先将待测样本预处理成含有目标DNA的溶液，再往溶液中加入对应的三个发夹探针H1、H2、H3，目标DNA识别并打开H1，单向或双向引发H1和H2发生杂交链式反应，H2打开后其环序列引发打开H3形成多支杂交链式产物，通过打开的H3与界面的探针杂交将多支杂交链式产物多价捕获在界面，分析界面上的信号标记实现目标DNA的定量检测。本发明提供的检测方法中杂交链式反应在溶液中进行，显著提高杂交效率，再通过多价捕获的方式高效地将反应产物捕获到界面上，实现超灵敏核酸检测；设计的信号探针具有通用性，极大节约检测成本。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于多支杂交链式反应的核酸检测方法及其用于液体活检中药物/生物小分子、DNA、RNA、抗原/抗体、酶、外泌体和细胞中的精准分析检测。

背景技术

精准医学分析中的液体活检是当前热门的检测技术之一，血清、血浆或血液中特定DNA，RNA，药物/生物小分子，蛋白，外泌体以及细胞含量的变化，可用于早期疾病筛查与诊断、疾病术后复发判断以及药代水平监测。当前基因测序已成功应用于癌症早期筛查，通过检测基因突变预判人群患癌症的几率，该方法具有较高的准确率，然而该技术当前的检测成本仍较高，不利于广泛推广使用，因此迫切需要简便、低成本、高准确性的传感器研制。

随着DNA纳米技术的不断发展，涌现出了各种DNA纳米结构材料用于检测人体外周血中的疾病相关DNA，RNA等，由于人体外周血中的靶标分子含量普遍较低，当前研制的传感器常用滚环放大法(Rolling circle amplification,RCA)(Lizardi P.M.,Huang X.X.,Zhu Z.R.,Ward P.B.,Thomas D.C.,Ward D.C.,Nat.Genetics.,1998,19,225-232.)和杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)(Dirks R.M.,Pierce N.A.,P.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2004,101,15275-15278.)用于放大输出检测信号，检测各种生物靶标分子。HCR相比RCA不需要额外加入聚合酶，且在室温下就能发生反应，产物是具有重复单元的双链长链结构。

申请公布号为CN 106093438A的专利文献公开了一种利用杂交链反应便携式检测血管内皮生长因子的方法，在聚乙烯微孔上，将VEGF与适配体和抗体形成抗体-蛋白-适配体的夹心结构，在适配体的末端包含有一段18碱基的延长序列，然后利用合成的两端蔗糖转移酶标记的辅助探针，这两端酶标探针以18碱基的延长序列为模板，引发链杂交扩增反应，从而在微孔上固定大量的蔗糖转移酶，这些酶催化蔗糖转化为葡萄糖，利用血糖仪指示产生的葡萄糖浓度，进而测出待分析目标物中血管内皮生长因子的含量。

杂交链式反应已被广泛应用于各类生物靶标分子的检测，当前存在的主要瓶颈缺陷有以下几点：

a.HCR在溶液环境中对比在界面的杂交效率更高，然而溶液中常用的信号输出方法如荧光、显色、化学发光等，其信号输出灵敏度相对界面技术较差；信号输出灵敏度相对更高的电化学、界面荧光增强、拉曼光谱和表面等离子共振等技术，又需要HCR在界面进行，降低了HCR的杂交效率。

b.HCR中使用的发卡探针不能通用，随着检测对象的改变而改变。

c.HCR中使用的发卡探针稳定性随着检测对象的改变而改变，发卡结构稳定性较差时，容易自身引发杂交链式反应，降低检测过程中的信噪比。

d.界面引发杂交链式反应的传感器一般灵敏度更高，但通常需要多步骤进行靶标检测。

e.不能调控靶标的有效检测浓度范围。

当前发展出的利用杂交链式反应结合酶催化的方法可以实现DNA和RNA几百个甚至几十个拷贝的检测灵敏度，然而这些方法均较为繁琐，需要多步骤处理实现靶标分子的检测，使这些方法局限于实验室的理想检测环境，难以应用于临床检测。